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第一部分神经母细胞瘤组织和细胞中mi R-558上调与HPSE表达水平呈正相关目的:探讨mi R-558、HPSE在神经母细胞瘤组织和细胞株中的表达水平及二者的关联性。方法:通过mi RNA–promoter interaction database和AGO–chromosome interaction profiling data(GSE40536)软件预测AGO蛋白富集的HPSE启动子区域所能结合的mi RNAs;双荧光素酶实验验证预测到的mi RNAs对HPSE启动子活性的影响;通过R2数据库检索mi R-558宿主基因BIRC6(baculoviral IAP repeat containing 6)在神经母细胞瘤中的表达水平;实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例NB标本、正常脊髓背根神经节和培养的SK-N-SH、SK-N-AS、SH-SY5Y和SK-N-BE(2)细胞系中成熟mi R-558水平;Western blot assay进一步验证HPSE的表达水平及其与mi R-558的关系。结果:AGO1富集于HPSE转录起始位点(TSS)上游-2468/-2591 bp区域,该区域存在mi R-145、mi R-558和mi R-17的结合位点,分别位于HPSE TSS上游-2330/-2345、-2314/-2332和-2292/-2313 bp的位置;双荧光素酶实验表明转染mi R-558 inhibitor和mimic能导致HPSE启动子活性分别降低、增高,而mi R-145或mi R-17对启动子活性没有影响;R2数据库分析表明:与正常背根神经节相比,BIRC6的表达在88例NB组织中是上调的(P<0.0001)。此外,BIRC6的水平与International Neuroblastoma Staging System(INSS)分期(P=0.007)、神经母细胞瘤的侵袭性(P=0.0079)相关联;q RT-PCR检测表明:与正常背根神经节比较,成熟mi R-558在神经母细胞瘤组织和细胞中表达上调;Western blot检测表明HPSE在NB组织和细胞系中高表达。在NB组织和细胞系中,mi R-558的表达与HPSE的转录水平呈正相关(R=0.633,P<0.0001)。在低分化(P=0.0001)的NB组织中,观察到更高的mi R-558表达或更高的HPSE蛋白水平(P=0.0011)。结论:在NB组织和细胞系中,神经母细胞瘤分化程度越低,mi R-558和HPSE表达量越多,mi RNA可以调节HPSE的转录,且mi R-558上调与HPSE的表达水平呈正相关。第二部分mi R-558促进HPSE表达的机制研究目的:研究mi R-558是在转录水平还是在翻译水平促进HPSE的表达。方法:分别进行了mi RNA-558敲低和过表达实验:anti-mi R-558 inhibitor转染神经母细胞瘤细胞后,q RT-PCR及Western blot检测HPSE、VEGF新生转录本和蛋白水平;过表达mi R-558后,RT-PCR及Western blot检测HPSE、VEGF在NB细胞中的表达情况;通过mi RNA–启动子相互作用数据库检索在HPSE的3′-UTR有无mi R-558的结合位点。结果:敲低mi RNA-558导致SH-SY5Y和SK-N-BE(2)细胞中HPSE、VEGF新生转录本和蛋白水平下降;mi R-558稳定表达细胞系检测的结果是相反的。在神经母细胞瘤细胞系,敲低或过表达mi R-558对VEGF 3’-UTR和HPSE 3’-UTR的双荧光素酶活性无影响,表明mi R-558不参与转录后调控。结论:在神经母细胞瘤中,mi R-558通过转录激活进而促进HPSE的表达,并通过HPSE调节VEGF的表达,mi R-558不参与HPSE的转录后调控。第三部分mi R-558通过靶向HPSE促进神经母细胞瘤细胞体外生长、侵袭、转移及血管生成活性目的:通过敲低和过表达mi RNA-558,研究其对培养的神经母细胞瘤细胞生物学功能(生长、侵袭、转移、血管形成)的影响,通过回补HPSE进一步研究对生物学功能的改变。方法:通过转染mi R-558质粒,建立稳定表达mi RNA-558的SH-SY5Y、SK-N-SH细胞系。MTT比色法和软琼脂实验检测敲低或过表达mi R-558对肿瘤细胞生存与生长能力的影响;划痕迁移实验检测敲低或过表达mi R-558对NB细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测转染敲低或过表达mi R-558后,NB细胞侵袭能力的改变;转染了敲低mi R-558或过表达mi R-558的NB细胞上清被用来进行血管形成实验;分别过表达和敲低HPSE回补HPSE的水平,进行回补实验,Western blot检测HPSE和VEGF的表达水平。结果:Western blot结果显示转染HPSE可以回补mi R-558敲低所引起的HPSE和VEGF的下调。MTT比色法和软琼脂实验表明:anti-mi R-558 inhibitor转染的肿瘤细胞生存与生长能力降低;在划痕迁移实验中,anti-mi R-558 inhibitor抑制SH-SY5Y和SK-N-BE(2)细胞的迁移能力;Transwell实验表明:转染了anti-mi R-558 inhibitor的NB细胞相对于转染anti-NC的细胞而言,侵袭能力减弱;用anti-mi R-558 inhibitor转染的NB细胞的上清预处理基质胶后,内皮细胞血管形成受抑制;另一方面,mi R-558过表达的作用是相反的;而且,通过转染HPSE或HPSE si RNA恢复HPSE的表达可以回补这些生物学功能的改变。同时,恢复VEGF的水平只能部分抑制NB细胞中转染mi R-558所引起的生长、迁移、侵袭和血管生成等生物学特征的改变。结论:mi R-558通过靶向HPSE显著促进NB细胞的体外生长、迁移,侵袭和血管生成。第四部分敲低mi R-558抑制神经母细胞瘤细胞体内生长、转移和血管生成目的:研究敲低mi RNA-558对肿瘤体内生长、转移和血管形成的影响。方法:经尾静脉注射anti-mi R-558 inhibitor观察对SH-SY5Y细胞建立的皮下种植瘤裸鼠模型的影响,记录瘤体的体积及重量;裸鼠体表瘤体行免疫组织化学染色检测CD31-阳性微血管和平均血管密度;鼠尾转移模型的肺组织行HE染色检测转移灶的数目。结果:与anti-NC处理组相比,anti-mi R-558 inhibitor组裸鼠皮下种植瘤的肿瘤体积和重量都是下降的;在转移模型中,用anti-mi R-558 inhibitor处理的裸鼠比anti-NC处理组形成的肺转移灶更少;免疫组织化学染色表明用anti-mi R-558inhibitor处理后导致肿瘤内的CD31-阳性微血管和平均血管密度下降。结果:敲低mi R-558能抑制NB细胞的体内生长、转移和血管生成。