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第一部分白血病抑制因子在牙胚发育过程中的时空表达特点研究目的:研究白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在小鼠磨牙牙胚发育各个阶段中的表达特点。研究方法:获取胚胎期13.5天、15.5天、16.5天、18.5天小鼠胚胎以及出生后3天乳鼠。经脱钙及切片后进行免疫组化染色检测LIF在磨牙牙胚内的表达情况。实验结果:免疫组化结果显示,在胚胎期13.5天（蕾状期）、15.5天（帽状早期）、16.5天（帽状后期）小鼠磨牙牙胚内,所有细胞均未见LIF表达。在胚胎期18.5天（钟状期）小鼠牙胚内,可见LIF表达于内釉上皮及牙囊。在小鼠出生后3天小鼠牙胚内,可见LIF表达于成牙本质细胞及星网状层内,且在成釉细胞内高表达。结论:LIF表达于钟状期牙胚及出生后小鼠牙胚内,提示LIF可能参与釉质发育过程并发挥特定作用。第二部分Lif基因敲除小鼠釉质的表型研究研究目的:研究LIF缺失对小鼠釉质发育的影响及相关表型。研究方法:构建Lif基因敲除杂合小鼠,通过杂合子合笼交配获取Lif基因敲除小鼠,在所有实验中均以同窝野生型小鼠作为对照。经聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）、凝胶电泳和免疫组化染色鉴定基因型并检测LIF表达情况。场发射电子扫描显微镜（Scanning electronic microscopy,SEM）观察釉质表面形貌及显微结构;显微CT（Micro-Computed Tomography,Mirco-CT）分析牙形态及釉质矿化密度;显微硬度计测量釉质及牙本质硬度;检测牙酸蚀溶液内钙离子浓度以表征其抗酸蚀性能;X射线能谱分析（EDS,Energy dispersive spectroscopy）检测釉质表面元素种类及含量;普鲁士蓝染色检测成釉细胞内铁离子分布及含量。实验结果:通过杂合子小鼠合笼交配成功获得Lif基因敲除小鼠与野生型小鼠,并发现Lif基因敲除小鼠切牙表面呈白垩色,有别于野生型及杂合子小鼠的黄褐色。免疫组化染色证实LIF在野生型小鼠切牙成熟期成釉细胞内高表达,而Lif基因敲除小鼠内未见LIF表达。SEM结果显示Lif基因敲除小鼠切牙釉质形貌及显微结构无显著差异。Mirco-CT显示Lif基因敲除小鼠切牙较野生型小鼠短,但其釉质矿化密度无显著差异。此外,Lif基因敲除小鼠釉质表面维氏硬度及抗酸蚀能力显著降低。EDS和组织学染色证实,与野生型小鼠相比,Lif基因敲除小鼠切牙釉质表面铁沉积减少,成釉细胞内未见铁离子着色。结论:Lif基因敲除小鼠切牙釉质表面铁沉积减少,导致其表面呈白垩色,并伴有表面硬度和抗酸蚀能力下降。第三部分LIF作用于小鼠釉质发育的相关机制研究研究目的:探索LIF缺失引起小鼠切牙釉质表面铁沉积减少的潜在机制。研究方法:采集小鼠血液并分离获得血清,检测血清中铁离子含量及相关指标。苏木精伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察切牙成釉器及细胞形态,实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantative reverse transcription-PCR,q RT-PCR）和免疫组化检测LIF基因敲除小鼠分泌期成釉细胞内釉质基质蛋白相关基因与釉原蛋白的表达,以及成熟期成釉细胞内铁转运相关基因及蛋白的表达情况。体外培养小鼠成釉细胞系（Ameloblasts like leanage cells,ALC）并构建Lif敲低成釉细胞系（ALC-Lif-Sh）,通过q RT-PCR和蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）技术检测Lif敲低效率以及铁转运相关蛋白表达变化。在ALC培养过程中给予不同浓度的重组细胞因子LIF刺激,Western blot检测铁转运相关蛋白的表达变化以及下游通路的激活情况。选取LIF刺激的最优浓度,同时加入通路抑制剂培养成釉细胞系,Western blot检测铁转运相关蛋白的表达变化以及对应通路的变化。通过碱性磷酸脂酶（Alkaline Phosphatase,ALP）染色、茜素红染色、q RT-PCR和Western blot探究LIF在成釉细胞系矿化过程中的作用。实验结果:LIF敲除小鼠体内血铁相关指标与野生型无显著差异。HE染色显示Lif基因敲除小鼠成熟期成釉细胞显著短于野生型小鼠。q RT-PCR和免疫组化结果显示,LIF缺失对分泌期成釉细胞内釉原蛋白（Amelogenin,AMELX）、成釉蛋白（Ameloblastin,AMBN）、釉蛋白（Enamelin,ENAM）、激肽释放酶4（Kallikrein4,KLK4）的转录水平以及AMELX的表达水平无显著影响。而Lif基因敲除小鼠成熟期成釉细胞内转铁蛋白受体（Transferrin receptor,TFRC）、膜铁转运蛋白（Solute carrier family 40 member 1,SLC40A1）、轻链铁蛋白（Ferritin-light chain,FTL）的转录水平以及TFRC、SLC40A1蛋白表达显著降低。体外细胞实验证实,在ALC-Lif-Sh细胞系内,LIF的干扰效率可达65%左右,且Tfrc、Slc40a1、Ftl的转录水平与TFRC、SLC40A1的表达水平显著降低,与体内实验结果一致。此外,10 ng/m L与20 ng/m L LIF刺激能显著促进TFRC、SLC40A1的表达,并伴有信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）信号转导通路激活。在给予LIF刺激的同时加入STAT3通路抑制剂,能有效抑制STAT3信号转导通路激活并中和LIF对TFRC、SLC40A1表达的促进作用。尽管ALP染色无显著差异,但茜素红染色结果显示,LIF促进ALC矿化结节的形成,q RT-PCR和Western blot结果表明LIF能有效促进ALC矿化诱导过程中骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）和骨钙蛋白（Osteocalcin,OCN）的表达。结论:LIF通过STAT3信号转导通路调控ALC表达TFRC和SLC40A1,从而影响成熟期成釉细胞的铁转运过程。同时,在矿化过程中,LIF促进OPN与OCN的表达与矿化结节的形成。