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研究背景:骨细胞是骨组织中含量最丰富的细胞,在骨转换过程中发挥了重要作用,这已经被越来越多的研究所证实。而骨转换加速是氟骨症发病的主要环节,在此过程中氟刺激破骨细胞和成骨细胞致其出现不同程度的活跃,但氟对骨细胞影响的研究罕见报道。甲状旁腺激素(PTH)是甲状旁腺分泌的维持体内钙稳态的激素,同时调控骨转换过程,并参与了氟骨症的发病,研究证明骨细胞是PTH作用的关键效应物。因此本实验拟从体内、体外两方面探究氟对骨细胞的调控,以及其中PTH所起的作用,这在以往研究中很少涉及。本实验研究成果将对氟骨症发病机制的阐明具有一定意义。实验方案:1.体外实验:本课题以小鼠原代骨细胞作为研究对象。实验设对照组,1、4、16mg F-/L三个梯度氟组,PTH组以及三个梯度氟联合PTH组,共8组。原代骨细胞提取后在富含胶原的培养基中培养5天,进行E11/gp38及OCN免疫组化进一步鉴定骨细胞。之后给予浓度分别为0,1,4,16 mg F-/L的氟化钠,以及氟联合浓度为10nmol/L的PTH(1-34)进行处理,相关实验检测在加条件培养48小时后进行。不同条件下的细胞活性采用MTT法检测;原代骨细胞与RAW264.7细胞共培养5天,之后在光镜下计数各条件组形成破骨细胞样细胞的数量,并进行比较分析;暴露于氟及PTH不同条件下原代骨细胞内成骨、破骨相关因子如核因子κB受体活化因子配体/骨保护素、硬化蛋白及Wnt-β连环蛋白信号通路各因子在基因和蛋白水平表达的变化利用实时定量PCR和蛋白杂交技术分别检测。2.体内实验:实验设置对照组、低剂量氟组以及高剂量氟组3组,每组平均20只清洁级成年雄性Wistar大鼠。投氟处理5周后,在三组大鼠每组中选取一半给予PTH(1-34)试剂灌胃,实验最后分为:对照组,10mg F-/kg·day组,20mg F-/kg·day组,PTH组,10mg F-/kg·day+PTH组,20mg F-/kg·day+PTH组,共6组。PTH联合氟继续处理3周后处死大鼠(乙醚麻醉),收集股骨、胫骨等骨组织测定骨密度,经眼球取血进行生化分析,并应用实时定量PCR检测骨组织相关基因。实验过程中每周对大鼠进行称重并观察其牙齿变化。氟中毒大鼠骨组织的骨密度、成骨、破骨标志物水平及相关基因的变化是主要观察对象。动物实验部分主要确定氟骨症大鼠模型的成功复制,进一步验证体外实验的结果以及明确PTH对氟骨症骨转换加速过程的影响。实验结果:1.体外实验:成功从3月龄雄性ICR小鼠股骨分离原代骨细胞并培养,免疫组化确定骨细胞E11/gp38高表达及OCN低表达的特征。MTT结果显示低剂量氟轻度刺激骨细胞活性,而高剂量氟轻度抑制其活性。PTH也表现为轻度抑制作用,但进一步调节了氟对骨细胞活性的影响。骨细胞对RAW264.7细胞诱导破骨细胞分化的作用明显,验证了在体外骨细胞分泌RANKL。投氟刺激骨细胞产生RANKL,并且PTH进一步加强了氟的促进作用。实时定量PCR结果表明,氟和/或PTH均明显抑制骨细胞中Sost表达,高剂量氟作用最明显。低、中剂量氟显著增加了RANKL基因表达和RANKL/OPG比例,PTH明显上调RANKL/OPG比例并大大增强了氟对RANKL/OPG的促进作用。进一步实验表明氟促进原代骨细胞PTH1R及Wnt/β-Catenin信号转导途径相关因子的基因表达,其中高氟对Wnt通路相关基因具有明显上调作用,却对PTH1R mRNA表达影响较小。单独给予PTH仅促进wnt 10b表达,但显著增强了氟对上述因子mRNA表达的上调作用。蛋白杂交结果验证了氟和单独PTH均抑制硬化蛋白表达和促进RANKL表达的增加,投氟和PTH的共同作用放大了氟对硬化蛋白的抑制趋势,但PTH和16mgF-/L共同作用明显上调硬化蛋白的表达而大大降低RANKL蛋白。同时,高氟显著上调β-连环蛋白及Smad3蛋白的表达。以上结果说明氟通过调控骨细胞产生的硬化蛋白、Wnt/β-Catenin信号通路相关因子及RANKL表达进而影响成骨细胞及破骨细胞活动,PTH作用与之类似,并进一步通过其受体信号通路在氟调控骨细胞功能的过程中发挥了重要作用。2.体内实验:投氟大鼠氟斑牙病损随着投氟剂量的加大和时间的延长而更加明显。大鼠的氟斑牙损害程度在PTH联合氟处理组较相同投氟条件下严重。在对大鼠骨密度的影响方面,低氟及间歇给予PTH轻度升高骨密度,高氟明显降低了大鼠的骨密度,氟与PTH共同作用升高骨密度。血清PINP在高氟组及CTx在各组分泌显著增加说明氟和单独给予PTH均促进骨转换,高剂量氟更明显,同时,氟联合PTH明显促进血清PINP分泌说明二者联合进一步加强了骨转换尤其成骨方面的作用。这与大鼠骨密度变化是一致的。进一步的大鼠股骨组织实时定量PCR结果表明,氟对OCN表达轻度上调及Runx2 mRNA轻度抑制的作用均不明显说明氟对成骨细胞介导的骨形成的作用弱,高剂量氟和PTH共同作用导致OCN表达受抑制却显著上调Runx2基因则提示间歇给予PTH可逆转高氟对成骨细胞功能的作用。投氟或PTH均显著抑制Sost表达,低剂量的氟和PTH仍明显下调Sost的表达,但高剂量氟和PTH作用下Sost表达却明显增加。PTH显著增加wnt10表达,氟和PTH的共同作用进一步促进了股骨中该基因表达。在破骨方面,氟和PTH单独应用均明显上调了大鼠股骨中的RANKL mRNA表达,低剂量氟和PTH的共同作用进一步促进了RANKL表达,但PTH与高剂量氟却致其显著降低。氟和/或PTH对大鼠骨组织Sost及RANKL表达的影响与体外骨细胞蛋白杂交结果类似。此外,PTH明显增强了氟对PTH1R的诱导作用。而Smad3基因表达随着投氟剂量的增多而增高,以高氟最显著,PTH明显促进其表达,低氟及PTH联合应用进一步促进该基因表达,高氟联合PTH则显著抑制Smad3基因。投氟不同剂量、PTH、低氟联合PTH均轻度抑制TGFR1表达,高氟与PTH联合应用则明显促进TGFR1基因。以上结果提示大鼠暴露于不同氟浓度能够引起骨转换活跃,这可能是部分的通过下调Sost及促进RANKL表达实现的,单独应用PTH也不同程度的增强成骨及破骨活动,并进一步促进低剂量氟的作用,但逆转了高剂量氟的作用,说明PTH在氟刺激骨转换过程中发挥了重要作用。同时这些结果也精确的反映了硬化蛋白以及RANKL的主要来源是骨细胞。本课题研究表明氟抑制骨细胞产生的硬化蛋白,调节RANKL/OPG比例并通过影响Wnt/β-Catenin信号通路影响骨形成和骨吸收。骨细胞在氟加强骨转换过程中可能发挥了关键作用,而PTH通过其受体信号通路参与了氟对硬化蛋白、Wnt/β-Catenin信号通路以及RANKL表达的调节。与此同时,PTH通过上调RANKL及抑制硬化蛋白表达增强了低氟促进骨转换的作用,而通过反向调节上述因子表达进而影响高剂量氟的作用。以上这些发现可能会对氟骨症发病机制的研究提供新的线索和思路。