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利用纤维素酶将廉价而丰富的植物生物质材料降解为可用于微生物发酵的简单糖原来进行生物燃料或其他大宗化学品的生产具有相当广阔的应用前景。丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)作为目前生产纤维素酶最主要的工业菌株有着强大的蛋白分泌能力,其中某些突变株的纤维素酶分泌量可高达100 g/L,近年来也作为一种优质的重组蛋白表达宿主被广泛使用。在其纤维素酶酶系中,纤维二糖水解酶I(CBHI)作为里氏木霉最主要的外分泌蛋白,分泌量可占总外分泌蛋白的64%-80%,然而,在纤维素降解类丝状真菌中,来源于里氏木霉的CBHI比活力并不太高。目前,生物质降解酶类的成本过高是木质纤维素类物质有效利用的主要障碍之一,因此,通过遗传改造里氏木霉菌株,优化其纤维素酶组成,进一步提高其纤维素酶生产能力不仅可以有效促进纤维素物质的合理利用,对改善环境污染,推广经济环保型燃料等也有着重要意义。本论文就提高里氏木霉CBHI的比活力及其外分泌蛋白产量作了如下相关研究:1.drs2基因对里氏木霉蛋白分泌的影响研究基于丝状真菌模式菌株——粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的drs2基因(基因ID为NCU00352)缺失株胞外蛋白分泌量显著提高这一发现,这项研究敲除了里氏木霉的drs2基因,以期提高其细胞外蛋白质分泌。研究发现,里氏木霉△drs2菌株相较于其出发株里氏木霉Tu6△ku70,胞外蛋白分泌量提升了2-3倍。该结果表明敲除drs2基因影响了其生长,同时有助于提高里氏木霉的细胞外蛋白质分泌。2.里氏木霉CBHI和嗜热毛壳菌CBHI的酶学性质比较嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)具有胞外蛋白分泌量低而酶活高的特点,相反,里氏木霉中的CBHI具有表达量大而比活低的特点,因此开发研究嗜热毛壳菌CBHI或许能够得到优于里氏木霉的CBHI的替代酶。本研究利用cDNA1组成型启动子并结合里氏木霉cbh1基因的信号肽序列,在里氏木霉中分别表达了来源于里氏木霉和嗜热毛壳菌的CBHI,使得葡萄糖碳源条件,CBHI为唯一被分泌表达的纤维素酶,从而可以在不受其他纤维素酶组分的影响条件下,只进行CBHI的活性比较。研究分析发现:相较于里氏木霉的CBHI,嗜热毛壳菌的CBHI比活力约为其4-5倍;嗜热毛壳菌的CBHI在40℃-70℃、pH 3-7条件下都有活性,其最适温度为70℃,最适pH为4;里氏木霉的CBHI则是在50℃-60℃、pH 4-6条件下都有活性,其最适温度为60℃,最适pH为4。该研究表明相比里氏木霉CBHI,嗜热毛壳菌CBHI具有更高的比活力、与广泛的pH和温度适应性,其酶学性质明显优于里氏木霉CBHI。3.利用嗜热毛壳菌CBHI基因优化里氏木霉的纤维素酶酶系组成由以上结果可知,嗜热毛壳菌CBHI的酶学性质明显优于里氏木霉CBHI,而里氏木霉CBHI表达量可占里氏木霉外分泌蛋白64%以上,cbh1基因的启动子通常作为强启动子进行重组基因的表达。因此,本研究将嗜热毛壳菌CBHI基因替换里氏木霉CBHI,并置其于里氏木霉cbh1启动子和信号肽序列之下,以探索这种纤维素酶系的重新组合是否有利于进一步提高里氏木霉的纤维素降解能力。研究表明,相较于出发株,在以微晶纤维素为底物时,重组菌株的滤纸酶活提升了3倍。