野樱莓原花青素的提取纯化、纳米颗粒制备及其稳定性的研究

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野樱莓富含丰富的酚类化合物,其中原花青素含量可达总酚的66%以上。研究表明原花青素具有抗氧化、保护神经、抗病毒、保护心脏、抗菌等生理功能,但其稳定性较差,限制了其加工生产及食品等领域的应用。因此提取纯化野樱莓中原花青素,并提高其稳定性具有重要意义。本研究比较了不同方法提取野樱莓原花青素的效果,优化提取方法,并对原花青素提取物进行富集纯化,最后采用玉米醇溶蛋白(zein)纳米颗粒负载原花青素以提高其稳定性。具体研究结果如下:(1)野樱莓原花青素的提取:通过单因素和Box-Behnken响应面设计对超声微波协同提取法(ultrasonic-microwave assisted extraction,UMAE)提取野樱莓原花青素的工艺进行优化,得到最佳工艺参数为液料比为62:1 m L/g,乙醇浓度为62%(v/v),微波功率为434 W,提取时间为4.5 min。在最佳提取工艺条件下,原花青素得率为31.52±0.8 mg/g FW,纯度为16.34±0.59%。通过对比超声微波协同提取法(UMAE)和超声提取法(ultrasonic-assisted extraction,UAE)、微波提取法(microwave-assisted extraction,MAE)、传统提取法(traditional solvent extraction,TSE)发现,UMAE的提取得率、纯度最高;并测定了ABTS+·、DPPH、超氧阴离子自由基以及总还原力等抗氧化活性指标,结果表明经UMAE得到的野樱莓原花青素提取物具有最高的抗氧化活性。通过冷场发射扫描电镜(FE-SEM)观察微观形态,发现经UMAE提取后的野樱莓残渣破坏的更加彻底,细胞壁受损程度更严重,更加有利于原花青素的溶出,且提取时间较短(4.5 min),远远少于其他三种提取方式(UAE-60 min;MAE-40 min;TSE-360 min),提高了效率,降低了能耗。因此UMAE是提取野樱莓原花青素的最佳方式。(2)野樱莓原花青素提取物的纯化:通过静态和动态吸附从十种树脂中筛选出对原花青素分离效果最好的HP-20树脂,对野樱莓原花青素进行纯化工艺的优化,得到最佳的纯化工艺:上样流速1 BV/h,上样浓度3 mg/m L,洗脱流速为1 BV/h。首先对原花青素提取物进行富集,收集35%(v/v)乙醇洗脱组分,得到富集物纯度为65.37±3.52%;再将富集物进行纯化,30%乙醇梯度洗脱组分(30%EC-PPA)纯度最高,为93.59±2.73%,其次是40%乙醇梯度洗脱,其纯度为84.93±4.18%。并对比了提取物、富集物和各梯度纯化物的抗氧剂活性,发现30%EC-PPA的抗氧化活性最高。基于高纯度的30%EC-PPA良好的生理活性,对其进行了超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和平均聚合度分析。UPLC-Q-TOF-MS结果表明纯化物中大部分都是以表儿茶素为基本单位的B型原花青素,有B型原花青素二、三、四聚体的多种异构体,通过硫解试验得出纯化物的平均聚合度为5。(3)纳米颗粒负载原花青素研究:原花青素本身对光照、温度等比较敏感,利用玉米醇溶蛋白的自组装特性形成纳米颗粒负载原花青素,提高原花青素的稳定性。本研究探究了反溶剂沉淀法(anti-solvent precipitation method,ASP)和柠檬酸交联法(citric acid crosslinking method,CAC)两种方法制备zein纳米颗粒负载原花青素的最佳制备条件。结果显示ASP得到的纳米颗粒粒径为522.0±9.46 nm,包埋率为91.56±0.98%;而由CAC制备得到纳米颗粒粒径更小(284.1±7.34 nm),且包埋率更高(94.13±1.04%)。通过对比两种方式制备的纳米颗粒的FE-SEM图、荧光光谱、傅里叶红外变换、圆二色谱、X射线衍射以及相互作用力,发现在ASP制备的纳米颗粒中疏水相互作用为主要的作用力;而zein与柠檬酸交联后除了疏水相互作用,氢键和静电相互作用力也参与了其形成,改变了二级结构和结晶度,使得纳米颗粒形成更加致密圆滑的外壳。(4)原花青素纳米颗粒稳定性试验对ASP和CAC制备的负载原花青素玉米醇溶蛋白纳米颗粒进行了一系列的稳定性分析和胃肠道模拟消化,在热稳定性、再分散性、冻融性、p H稳定性、Na Cl稳定性以及温度储藏稳定性方面,柠檬酸交联法制备的纳米颗粒要明显优于反溶剂沉淀法制备的纳米颗粒,能够显著提高原花青素的环境稳定性。通过胃肠道模拟消化试验表明,柠檬酸交联玉米醇溶蛋白纳米颗粒对胃肠等恶劣环境的抵抗力更强,原花青素生物可及率也显著提高了20%左右。
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