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目的:1.3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate,3-BrPA)抑制人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z细胞的增殖和诱导死亡的作用。2.3-BrPA作用于人鼻咽癌细胞是否通过活性氧(ROS)水平的变化引起细胞程序性坏死。方法:1.人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z经过药物处理后采用MTT法检测细胞存活率;集落克隆法检测药物处理后细胞集落形成情况;不同浓度的3-BrPA处理人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z 5h,用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平检测试剂盒检测。2.PI单染法用流式细胞仪检测3-BrPA(0,80,160,320μM)作用于人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z细胞死亡率。线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测3-BrPA(0,40,80,160μM)作用于人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z 24 h后的细胞线粒体膜电位变化。3.用Caspase抑制剂z-VAD-fmk(20μM)或RIPK1抑制剂necrostatin-1(Nec-1,20μM)预处理人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z 1h。预处理后,3-BrPA(160μM或320μM)联合使用z-VAD-fmk(20μM)或Nec-1(20μM)。采用MTT法检测存活率,来明确两株细胞死亡形式;最后将HNE1和CNE-2Z用3-BrPA(160μM或320μM)处理后,用电镜观察细胞形态和细胞器的变化,进一步验证两株细胞HNE1和CNE-2Z的死亡形式。4.Western blot法检测药物处理人鼻咽癌细胞HNE1及CNE-2Z对相关蛋白表达水平的影响。5.人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z分别用3-BrPA(160μM或320μM)处理不同时间后,在细胞内装载超氧阴离子探针(DHE),采用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的含量变化情况;并用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC,5m M)预处理细胞1h,用NAC与3-BrPA共同作用于细胞,继而检测细胞内的ROS水平的变化。最后,3-BrPA联合NAC处理细胞,使用MTT法检测细胞存活率。6.在裸鼠体内实验中,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。检测移植瘤的生长曲线,HE染色指标观察3-BrPA在体内是否具有抑制肿瘤生长的效果。结果:1.3-BrPA对鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z增殖的影响1.1采用MTT法检测,分析量效曲线可知在3-BrPA作用后人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z的增殖可以明显被抑制。并且随着3-BrPA作用于细胞的时间延长和浓度的逐渐增加,细胞增殖抑制作用明显增加。1.2检测3-BrPA对两株细胞HNE1和CNE-2Z增殖作用的影响,首先根据细胞存活率实验所得结果选用低于细胞IC50的药物浓度,观察集落形成数目。结果可以得出:低剂量浓度的3-BrPA对HNE1和CNE-2Z具有增殖抑制作用。1.3检测细胞内ATP含量,由实验结果显示3-BrPA(0,20,40,80,160,320μM)可以抑制鼻咽癌细胞内的ATP生成。2.3-BrPA诱导人鼻咽癌细胞死亡。2.2用不同浓度的3-BrPA作用于人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z,PI单染法检测结果显示:随着3-BrPA浓度增加,细胞死亡率增多。2.3 DAPI荧光染色法检测细胞核变化,结果显示随着3-BrPA浓度的增加细胞核呈现出浓缩致密,核裂现象逐渐增多。3.3-BrPA诱导线粒体膜电位发生变化。3.1应用荧光显微镜观察JC-1染色后,人鼻咽癌细胞线粒体膜电位变化,给药组同对照组的细胞相比较,可以观察到红色荧光逐渐向绿色荧光转变。这表明细胞内线粒体膜电位逐渐降低,细胞活性降低。3.2通过Western blotting法检测与有关蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bax及IAPs蛋白家族的变化,结果显示:蛋白Mcl-1、Bcl-2以及IAPs蛋白家族CIAP1、CIAP2、XIAP表达减少,蛋白Bax的表达增多。4.ROS产生在3-BrPA诱导的鼻咽癌细胞死亡中的作用。4.1将两株细胞用3-BrPA处理,在显微下观察得荧光强度。可以观察到细胞内活性氧水平明显升高。4.2检测细胞内平均荧光强度采用流式细胞仪。同空白组相比,3-BrPA作用不同时间段后,可以观察到随着药物作用时间延长细胞内活性氧水平明显增高。NAC和3-BrPA联合用药组细胞内ROS水平没有明显升高。4.3细胞存活率检测实验,结果表明NAC(5m M)可以抑制3-BrPA诱导的细胞死亡。表明3-BrPA是细胞内ROS水平失衡而诱导的细胞死亡。5.3-BrPA诱导鼻咽癌细胞产生程序性坏死。5.1 Caspase抑制剂z-VAD-fmk(20μM)与3-BrPA联合使用后,HNE1和CNE-2Z的细胞存活率不受影响,而与RIPK1抑制剂Nec-1合用时,则发现细胞存活率增加。5.2 3-BrPA处理人鼻咽癌HNE1和CNE-2Z后电镜观察细胞,发现3-BrPA组细胞器膨胀,细胞呈空泡状,具有程序性坏死的特征。6.3-BrPA在裸鼠体内抗肿瘤效果6.1检测3-BrPA体内抑制肿瘤生长的作用,采用人鼻咽癌CNE-2Z异种移植瘤裸鼠模型。裸鼠肿瘤生长曲线表明:3-BrPA组的肿瘤生长曲线同空白组相比生长曲线平缓肿瘤体积较小,但效果略差于顺铂(DDP)组。苏木精-伊红染色法(HE染色)结果表明,3-BrPA给药组与空白组相比较起来,有大面积坏死区域存在。结论:1.3-BrPA对人鼻咽癌细胞HNE1和CNE-2Z的具有增殖抑制和诱导死亡的作用。2.3-BrPA诱导的鼻咽癌细胞死亡为程序性坏死,细胞死亡与细胞内ROS水平升高有关。