目的:膀胱癌是发生在膀胱黏膜层的上皮性肿瘤。膀胱癌发病率较高,是我国最常见的泌尿系肿瘤。膀胱癌对传统的放疗化疗并不敏感,且由于膀胱癌细胞生物表型上的多样性,高病理分期的膀胱癌治疗效果及预后均不理想。新型分子靶向药物,通过激活抑癌基因或抑制癌基因的表达,降低膀胱癌的复发及远处转移。近年来,许多研究发现UNC5B是P53的直接靶基因,UNC5B可在缺少netrin-1结合或其自身过表达时,介导细胞凋亡并抑制细胞增殖。同时,UNC5B在多种肿瘤中具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的生物学效应,并可增强化疗药对肿瘤的敏感性。本研究通过慢病毒转染、蛋白质谱分析和免疫沉淀实验鉴定UNC5B结合的相关结合蛋白,通过生物信息学分析其激活的分子通路及重要靶点,综合利用流式细胞技术、基因敲减技术及体内实验,深入探索UNC5B调控膀胱癌细胞周期、抑制肿瘤增殖的分子机制。方法:1.确定UNC5B在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中的内源性表达。在中国医科大学附属第一医院泌尿外科的病理标本库中,选取20对经病理报告确认的膀胱癌与癌旁组织。应用PCR和WB法检测UNC5B在膀胱癌标本。用同样方法检测7种膀胱癌细胞器中UNC5B的表达,选取合适的细胞进行进一步实验。2.构建UNC5B胞内段真核表达体并转染膀胱癌细胞,明确其抑癌作用。构建UNC5B胞内段真核表达体,并将其与全长UNC5B对选定细胞进行转染。利用荧光镜检测细胞内绿色荧光的强度的变化;利用PCR检测细胞UNC5B的m RNA水平变化;利用Western Blot检测UNC5B蛋白水平的变化;利用流式细胞检测技术检测UNC5B的荧光信号。利用实时细胞增殖实验及流式周期分析确定UNC5B的生物学效应。3.通过蛋白质谱技术及生信分析鉴定UNC5B介导的通路变化及相关因子。对不同组的膀胱癌细胞进行免疫共沉淀、快银染色及质谱检测,鉴定组间的差异蛋白,利用生信分析（GO分析）预测UNC5B相关的代谢途径;利用蛋白互作网络图（PPI分析）分析潜在的蛋白互作模式;利用KEGG鉴定UNC5B激活的特定通路及重要靶基因。4.通过免疫共沉淀、周期蛋白检测及动物实验验证UNC5B的体内抑癌效应。根据蛋白质谱鉴定,通过免疫共沉淀实验检测UNC5B与CDC14A及P53的结合;通过Western Blot检测细胞周期蛋白的变化;通过裸鼠成瘤实验确定UNC5B及UNC5B胞内段的体内抑癌效应;通过免疫组化测定小鼠种植瘤中Ki67及P53的表达,预测UNC5B在体内对肿瘤增殖的影响。5.回复实验进一步验证UNC5B介导细胞周期阻滞的作用机制。构建CDC14A的Si RNA及Sh RNA。利用Si RNA敲减CDC14A,检测细胞周期及相关周期蛋白的变化趋势;通过Sh RNA构建稳定敲减CDC14A的膀胱癌细胞,通过裸鼠成瘤实验及免疫组化实验验证敲除CDC14A对于细胞周期阻滞的影响,以明确UNC5B调控细胞周期的具体机制。结果:1.UNC5B在膀胱癌组织中低表达,其中癌旁组织的表达略高于癌组织。5637是膀胱癌细胞中UNC5B表达量最高的细胞,T24是表达量最低的细胞。PCR、Western Blot、荧光镜及流式细胞技术确认了UNC5B在5637及T24细胞中的稳定转染。RCTA细胞增殖实验显示,UNC5B抑制了膀胱癌细胞的增殖。流式周期检测证实,UNC5B介导膀胱癌细胞阻滞于G2/M周期。2.蛋白质谱检测及生信分析显示UNC5B的抑癌效应与细胞周期阻滞密切相关,其中CDC14A及P53是重要的调控因子。Co-IP及Western Blot证实,UNC5B通过结合CDC14A及P53使P53蛋白的Ser-315位点发生去磷酸化,从而下调了cyclin B1的表达,抑制了细胞周期的进程。裸鼠成瘤实验及免疫组化验证了UNC5B在体内的抑癌作用。3.敲减CDC14A回复了UNC5B介导的P53蛋白的去磷酸化,使cyclin B1的表达升高,而p-CDK1的表达减少,从而抑制了UNC5B介导的G2/M周期阻滞效应。裸鼠成瘤实验证实,CDC14A的敲减增加了种植瘤的体积,减弱了UNC5B在体内的抑癌效应。结论:1.UNC5B通过结合CDC14A和P53使膀胱癌细胞P53的Ser-315位点发生去磷酸化。这种去磷酸化通过降低cyclin B1的表达,增加p-CDK1的表达,促进G2/M期阻滞,从而抑制肿瘤的体内和体外增殖。2.UNC5B介导的细胞周期阻滞可能是治疗膀胱癌的一种潜在方法。