论文部分内容阅读
背景及目的:
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫炎性疾病，慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，该病好发于手、腕、足等小关节，反复发作，呈对称分布。在病理改变方面，类风湿性关节炎主要累及关节滑膜，后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌腱。RA发病与全身性自身反应性T细胞活化及关节局部滑膜组织中滑膜细胞异常增生有关。
人滑膜细胞主要分为A型、B型和C型三种，B型细胞即滑膜成纤维样细胞（Fibroblast-like synovial cells，FLS），是滑膜组织的重要组成部分[1]，能分泌各种蛋白酶、细胞因子和花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）代谢产物，这些物质能破坏关节和加速病程[2]。
本次实验拟在体外获得RA患者的滑膜成纤维样细胞(FLS)，并应用Anti-DR5mAb和caspase抑制剂研究Anti-DR5mAb对FLS生长的影响和对细胞因子分泌的影响。
方法:
本实验应用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化RA患者的膝关节滑膜组织，通过3次传代获得FLS;通过免疫荧光及流式细胞术检测vimentin、CD14的表达。
采用MTT法检测Anti-DR5mAb对FLS生长抑制作用，检测caspase抑制剂对Anti-DR5mAb诱导FLS生长抑制作用的影响。流式细胞术检测Anti-DR5mAb诱导FLS后DR5的表达及细胞凋亡率，检测caspase抑制剂和Anti-DR5mAb对FLS细胞周期的影响。免疫荧光Hochest33342检测Anti-DR5mAb诱导FLS凋亡的形态变化。Western blot检测 pro-caspase8、pro-caspase3、pro-caspase9、active-caspase3、active-caspase9、Bid、survivin、p38MAPK和NF-κ B蛋白表达。ELISA和RT-PCR分别检测FLS细胞分泌TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的蛋白及mRNA水平表达。
结果:
经胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化膝关节滑膜组织，通过3次传代，得到的第3代滑膜细胞（原代细胞为第0代细胞）在形态上均一，呈长梭形，有一定的增殖能力。该细胞的vimentin表达呈阳性，CD14的表达为阴性，表明所获得的细胞为RA的滑膜成纤维样细胞(FLS)，并能传代培养。
MTT结果显示Anti-DR5mAb对FLS有细胞毒性作用，作用12h后呈时间剂量依赖性。当Anti-DR5 mAb的浓度分别为:1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.3μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml时，作用4h对FLS细胞的生长抑制率分别为:5.4±1.7％、6.9±2.4％、10.7±4.8％、12.5±5.1％、10.9±1.0％、8.8±2.9％;作用12h对FLS细胞的生长抑制率分别为:12.2±0.6％、17.2±0.6％、23.8±0.3％、25.3±0.6％、26.2±0.1％、37.3±0.6％;作用24h对FLS细胞的生长抑制率分别为:6.6±0.9％、13.2±0.6％、34.8±3.5％、49.6±3.3％、51.6±2.6％、53.2±2.0％。当Anti-DR5 mAb浓度分别为0μg/ml、1.6μg/ml、6.3μg/ml和50μg/ml，流式细胞术检测DR5表达率分别为17.10％、20.30％、27.10％和45.90％;诱导FLS细胞24h的凋亡率分别为1.11％、20.72％、34.87％。免疫荧光Hochest33342染色发现50μg/ml组的细胞核有明显的碎裂，细胞凋亡作用明显，鼠源IgG与PBS组相比，细胞形态无明显变化，无核固缩。ELISA检测到Anti-DR5 mAb作用FLS细胞24h后分泌TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的蛋白水平降低;RT-PCR检测Anti-DR5 mAb作用FLS细胞24h后细胞TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的mRNA表达水平降低。Western blotting检测到Anti-DR5 mAb诱导凋亡的细胞内pro-caspase8、pro-caspase3、Bid和p38MAPK蛋白表达上调，survivin和NF-κ B蛋白表达下降。
MTT法分析，当Anti-DR5 mAb浓度为50μg/ml、caspase抑制剂的浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM和35μM时，FLS细胞的死亡率分别为49.45±0.84％、46.72±0.87％、41.41±0.80％、36.67±0.76％、29.56±0.81％、21.89±0.94％、14.38±0.87％、10.43±0.86％。流式检测FLS的细胞周期，Anti-DR5mAb主要阻滞FLS的G0/G1期和G2/M期，与正常对照组相比，50μg/mlAnti-DR5mAb组的G0/G1期和G2/M期比例显著增高(P＜0.05)，S期无显著变化;加入caspase抑制剂后，能抑制Anti-DR5mAb对FLS G0/G1期的阻滞，与Anti-DR5mAb组相比，50μg/ml Anti-DR5mAb+35μM caspase抑制剂组的G0/G1期比例显著下降(P＜0.01)，S期和G2/M期无显著变化。ELISA结果显示，与正常组相比，Anti-DR5mAb组和Anti-DR5mAb+caspase抑制剂组的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的表达下降显著(P＜0.001，P＜0.01);与Anti-DR5mAb+caspase抑制剂组相比，Anti-DR5mAb组的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的表达下降显著(P＜0.01)。Western blot检测结果显示，与正常组相比，Anti-DR5mAb组的pro-caspase3、active-caspase3、pro-caspase9、active-caspase9、Bid、p38MAPK的表达均增加，差异显著(P＜0.05)，survivin和NF-κB的表达显著下降(P＜0.05)，Anti-DR5mAb+caspase抑制剂组的active-caspase3、和active-caspase9表达均降低，差异非常显著(P＜0.001);与Anti-DR5mAb组相比，Anti-DR5mAb+caspase抑制剂组的pro-caspase3、active-caspase3、pro-caspase9、active-caspase9和p38MAPK的表达均显著增加(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001，P＜0.05)，survivin、NF-κ B的表达显著下降(P＜0.001，P＜0.05)。
结论:
1.获得了人类风湿性关节炎滑膜成纤维样细胞(FLS)，并能传代培养;
2.Anti-DR5 mAb能抑制FLS生长，作用12h后随时间的延长和剂量的增加呈依赖性，并通过阻滞FLS的G0/G1期和G2/M期诱导FLS发生凋亡，;
3.Anti-DR5 mAb与FLS细胞膜上的DR5结合，通过caspase通路诱导FLS发生凋亡，p38MAPK可能也参与Anti-DR5 mAb诱导FLS的凋亡途径;
4.Anti-DR5 mAb能使FLS细胞TNF-α、IFN-γ、TGF-β1炎症因子的mRNA和蛋白表达水平降低，其机制可能与NF-κ B有关。