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目的: 1.明确自噬蛋白 Beclin-1在β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)1-42诱导PC12细胞损伤中的动态变化及其作用; 2.探讨β-细辛醚对 Aβ1-42诱导 PC12细胞损伤中自噬的影响及其对PI3K-AKT-mTOR信号通路的作用; 3.观察β-细辛醚对Aβ1-42诱导PC12细胞线粒体损伤的作用。 方法: 1. Aβ1-42诱导PC12细胞损伤体外AD模型的建立:取生长至对数生长期的PC12细胞,加入0.25%胰酶-EDTA1 mL消化,1000 r/min离心3 min,弃上清液,用1 mL含10%血清的完全培养液重悬,调节细胞密度为5×104个/mL,每孔100μL接种在96孔培养板中(弃四周孔),四周孔以等体积的PBS代替;或调节细胞密度为1×105个/mL,每孔1 mL接种在24孔培养板中;细胞生长48 h后用于实验,弃培养基,用PBS洗一遍后,加入含相应药物浓度的无血清培养基预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液,37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。 2.取接种在96孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞,弃培养基,用PBS洗一遍后,在每个时间点细胞随机分成6组,正常组和不同浓度Aβ1-42模型组,每组设10个复孔,正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基,其余各组分别加入含不同浓度的Aβ1-42(0.625,1.25,2.5,5,10μmol/L)培养液,每孔100μL,37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养6-72 h后,置倒置相差显微镜下观察细胞形态的改变。分别在6、12、24、48、72 h时间点,取出培养板,吸取培养液,ELISA法检测神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)含量,MTT法检测细胞活力,考察细胞活力与NSE含量之间的相关性。取接种在24孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞,弃培养基,用PBS洗一遍后,加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42孵育,分别在3、6、12、24、48、72 h用流式细胞仪检测Beclin-1蛋白表达,探讨Beclin-1蛋白表达率与细胞活力之间的相关性。同时在Aβ1-42作用于PC12细胞之前通过使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬或自噬激活剂雷帕霉素激活自噬来考察自噬对细胞形态,细胞活力,NSE水平和Beclin-1蛋白表达的影响;透射电镜观察自噬体。另外,考察不同浓度3-MA或雷帕霉素对Aβ1-42诱导PC12细胞损伤中细胞活力的作用。 3.取接种在24孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞,弃培养基,用PBS洗一遍后,细胞随机分成7组,正常对照组,Aβ1-42模型组,3-MA+Aβ1-42组,雷帕霉素+Aβ1-42组,7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组,15μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组,30μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组,每组设10个复孔,正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基;Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液;3-MA+Aβ1-42组先加入浓度分别为5 mmol/L3-MA预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42;雷帕霉素+Aβ1-42组先加入浓度分别为100 nmol/L雷帕霉素预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42;β-细辛醚+Aβ1-42组先加入低、中、高浓度分别为7.5,15,30μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后,光镜下观察细胞形态,ELISA法检测NSE含量,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测Beclin-1蛋白表达,透射电镜观察自噬体。 4.取接种在12孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞,弃培养基,用 PBS洗一遍后,细胞随机分成4组,正常对照组,Aβ1-42模型组,7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组,NVP-BEZ235+Aβ1-42组,每组设10个复孔,正常对照组加入无血清 DMEM高糖培养基;Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液;β-细辛醚+Aβ1-42组先加入浓度为7.5μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42;NVP-BEZ235+Aβ1-42组先加入浓度为25 nmol/L NVP-BEZ235预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后,用流式细胞仪检测p-Akt, p-mTOR蛋白表达。 5.取接种在24孔培养板生长至对数生长期的PC12细胞,弃培养基,用PBS洗一遍后,细胞随机分成4组,正常对照组,Aβ1-42模型组,7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组,尼莫地平+Aβ1-42组,每组设10个复孔,正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基;Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液;β-细辛醚+Aβ1-42组先加入浓度为7.5μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42;尼莫地平+Aβ1-42组先加入浓度为10μmol/L尼莫地平预处理细胞1 h,再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后,用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度( intracellular calcium ion concentrations,[Ca2+]i),线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP);透射电镜观察自噬体和线粒体形态结构。 结果: 1. Aβ1-42可以诱导PC12细胞损伤和死亡,Aβ1-42作用于细胞后,其活力会下降。低浓度(0.625和1.25μmol/L)的Aβ1-42在12 h明显减少细胞存活率,但高浓度(2.5,5和10μmol/L)的Aβ1-42在6 h显著减少细胞存活率。不同浓度的Aβ1-42作用于细胞后,从6 h至72 h细胞培养基中NSE水平逐渐上调,这表明当细胞损伤时NSE水平显著上调。我们选择1.25μmol/L浓度的Aβ1-42作为诱导剂,从3 h到72 h检测Beclin-1在PC12细胞中的表达。Beclin-1在6 h表达上调,24 h达到高峰,表明在PC12细胞中Aβ1-42可以诱导Beclin-1介导的自噬。同时,自噬抑制剂3-MA预处理细胞可显著下调 Beclin-1蛋白表达,而自噬激活剂雷帕霉素预处理细胞则显著上调Beclin-1蛋白表达。此外,细胞经过雷帕霉素预处理后其形态很少发生改变,但3-MA预处理后细胞形态发生很大改变,表明自噬能保持细胞原有的形态。同时,低浓度雷帕霉素显著增加细胞活力,降低 NSE水平;3-MA显著降低细胞活力,升高NSE水平。 2.在Aβ1-42作用之前用β-细辛醚预处理细胞其形态很少会发生改变,但单独用Aβ1-42处理细胞后其形态通常会发生改变,表明β-细辛醚能保持原有的细胞形态。此外,β-细辛醚可以显著升高细胞活力并降低 NSE水平。这些结果表明,通过预处理β-细辛醚可以保护细胞免受Aβ1-42诱导的细胞毒作用。我们还证实,Aβ1-42可以诱导自噬并且使Beclin-1的表达增加,而β-细辛醚可以显著减少Beclin-1的表达,表明β-细辛醚可以减轻Aβ1-42诱导的自噬。同时,预处理自噬抑制剂3-MA可以显著抑制Beclin-1的表达,但预处理自噬激活剂雷帕霉素可以显著增强的Beclin-1的表达。 3.与正常对照组相比,Aβ组p-Akt和p-mTOR的水平显著下降。然而与Aβ组相比,β-细辛醚能显著增加p-Akt和p-mTOR的水平。PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235显著降低p-Akt和p-mTOR的水平。同时,与正常对照组相比,Aβ或NVP-BEZ235组的Beclin-1的表达分别增加,但在β-细辛醚组显著降低。这些结果表明,β-细辛醚通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路减轻细胞自噬,这可能是β-细辛醚对抗Aβ毒性发挥神经保护作用的机制。 4. Aβ1-42处理PC12细胞后出现[Ca2+]i升高,MMP降低。Aβ通过诱导细胞外Ca2+内流进入神经细胞的细胞质从而破坏神经细胞内Ca2+平衡,导致与Aβ相关的线粒体功能障碍和MMP下降。此时,自噬被诱导出来应对线粒体损伤和对抗Aβ诱导的细胞毒性。同时,在细胞应激发生前适度的调节自噬可以对抗Aβ诱导的细胞毒作用,调节Ca2+稳态,维持MMP。β-细辛醚可以降低钙离子浓度,提高MMP。 结论: 1. Aβ1-42的浓度对细胞存活率是一个重要因素,浓度越高,毒性越大。同时,随着时间的延长,细胞存活率逐渐下降。不同浓度的Aβ1-42和不同培养时间对 PC12细胞的存活率有不同的作用效果。Aβ1-42降低细胞活力具有剂量和时间依赖性。细胞活力与NSE水平呈负相关。在PC12细胞中,Aβ1-42可诱导Beclin-1介导的自噬,细胞活力和Beclin-1蛋白表达呈正相关。在损害发生之前,适度激活Beclin-1介导的自噬可以防止神经细胞死亡,而过度激活或抑制 Beclin-1介导的自噬可以加速细胞死亡。这些结果表明,在一定范围内适当激活Beclin-1介导的自噬可能有预防AD的作用。 2.β-细辛醚可以减轻 Aβ1-42诱导的Beclin-1介导的自噬,使得自噬发生在适当的水平以发挥保护作用。低剂量的β-细辛醚作用效果更好,其原因可能是因为β-细辛醚为小分子脂溶性成分,是通过主动转运的方式通过细胞膜进入细胞从而发挥作用,随着浓度的增高β-细辛醚作用于细胞时存在高浓度饱和现象,相互间有竞争性抑制现象,所以可以通过调节β-细辛醚的浓度以达到最好的作用效果。 3.β-细辛醚是通过PI3K-AKT-mTOR信号通路减轻Aβ诱导的自噬。β-细辛醚促进Akt的磷酸化,从而激活mTOR进一步促进mTOR的磷酸化,起到抑制自噬的作用。 4.β-细辛醚可以适度的调节 Beclin-1介导的自噬,对抗 Aβ1-42诱导的毒性作用,调节Ca2+稳态和维持MMP,保护线粒体形态结构。