目的：　　1.明确自噬蛋白 Beclin-1在β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）1-42诱导PC12细胞损伤中的动态变化及其作用；　　2.探讨β-细辛醚对 Aβ1-42诱导 PC12细胞损伤中自噬的影响及其对PI3K-AKT-mTOR信号通路的作用；　　3.观察β-细辛醚对Aβ1-42诱导PC12细胞线粒体损伤的作用。　　方法：　　1. Aβ1-42诱导PC12细胞损伤体外AD模型的建立：取生长至对数生长期的PC12细胞，加入0.25%胰酶-EDTA1 mL消化，1000 r/min离心3 min，弃上清液，用1 mL含10%血清的完全培养液重悬，调节细胞密度为5×104个/mL，每孔100μL接种在96孔培养板中（弃四周孔），四周孔以等体积的PBS代替；或调节细胞密度为1×105个/mL，每孔1 mL接种在24孔培养板中；细胞生长48 h后用于实验，弃培养基，用PBS洗一遍后，加入含相应药物浓度的无血清培养基预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。　　2.取接种在96孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞，弃培养基，用PBS洗一遍后，在每个时间点细胞随机分成6组，正常组和不同浓度Aβ1-42模型组，每组设10个复孔，正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基，其余各组分别加入含不同浓度的Aβ1-42（0.625，1.25，2.5，5，10μmol/L）培养液，每孔100μL，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养6-72 h后，置倒置相差显微镜下观察细胞形态的改变。分别在6、12、24、48、72 h时间点，取出培养板，吸取培养液，ELISA法检测神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）含量，MTT法检测细胞活力，考察细胞活力与NSE含量之间的相关性。取接种在24孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞，弃培养基，用PBS洗一遍后，加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42孵育，分别在3、6、12、24、48、72 h用流式细胞仪检测Beclin-1蛋白表达，探讨Beclin-1蛋白表达率与细胞活力之间的相关性。同时在Aβ1-42作用于PC12细胞之前通过使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制自噬或自噬激活剂雷帕霉素激活自噬来考察自噬对细胞形态，细胞活力，NSE水平和Beclin-1蛋白表达的影响；透射电镜观察自噬体。另外，考察不同浓度3-MA或雷帕霉素对Aβ1-42诱导PC12细胞损伤中细胞活力的作用。　　3.取接种在24孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞，弃培养基，用PBS洗一遍后，细胞随机分成7组，正常对照组，Aβ1-42模型组，3-MA+Aβ1-42组，雷帕霉素+Aβ1-42组，7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组，15μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组，30μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组，每组设10个复孔，正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基；Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液；3-MA+Aβ1-42组先加入浓度分别为5 mmol/L3-MA预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42；雷帕霉素+Aβ1-42组先加入浓度分别为100 nmol/L雷帕霉素预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42；β-细辛醚+Aβ1-42组先加入低、中、高浓度分别为7.5，15，30μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后，光镜下观察细胞形态，ELISA法检测NSE含量，MTT法检测细胞活力，流式细胞仪检测Beclin-1蛋白表达，透射电镜观察自噬体。　　4.取接种在12孔培养板中生长至对数生长期的PC12细胞，弃培养基，用 PBS洗一遍后，细胞随机分成4组，正常对照组，Aβ1-42模型组，7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组，NVP-BEZ235+Aβ1-42组，每组设10个复孔，正常对照组加入无血清 DMEM高糖培养基；Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液；β-细辛醚+Aβ1-42组先加入浓度为7.5μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42；NVP-BEZ235+Aβ1-42组先加入浓度为25 nmol/L NVP-BEZ235预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后，用流式细胞仪检测p-Akt, p-mTOR蛋白表达。　　5.取接种在24孔培养板生长至对数生长期的PC12细胞，弃培养基，用PBS洗一遍后，细胞随机分成4组，正常对照组，Aβ1-42模型组，7.5μg/mLβ-细辛醚+Aβ1-42组，尼莫地平+Aβ1-42组，每组设10个复孔，正常对照组加入无血清DMEM高糖培养基；Aβ1-42模型组加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42培养液；β-细辛醚+Aβ1-42组先加入浓度为7.5μg/mLβ-细辛醚预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42；尼莫地平+Aβ1-42组先加入浓度为10μmol/L尼莫地平预处理细胞1 h，再加入终浓度为1.25μmol/L Aβ1-42。37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后，用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度（ intracellular calcium ion concentrations，[Ca2+]i），线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）；透射电镜观察自噬体和线粒体形态结构。　　结果：　　1. Aβ1-42可以诱导PC12细胞损伤和死亡，Aβ1-42作用于细胞后，其活力会下降。低浓度（0.625和1.25μmol/L）的Aβ1-42在12 h明显减少细胞存活率，但高浓度（2.5，5和10μmol/L）的Aβ1-42在6 h显著减少细胞存活率。不同浓度的Aβ1-42作用于细胞后，从6 h至72 h细胞培养基中NSE水平逐渐上调，这表明当细胞损伤时NSE水平显著上调。我们选择1.25μmol/L浓度的Aβ1-42作为诱导剂，从3 h到72 h检测Beclin-1在PC12细胞中的表达。Beclin-1在6 h表达上调，24 h达到高峰，表明在PC12细胞中Aβ1-42可以诱导Beclin-1介导的自噬。同时，自噬抑制剂3-MA预处理细胞可显著下调 Beclin-1蛋白表达，而自噬激活剂雷帕霉素预处理细胞则显著上调Beclin-1蛋白表达。此外，细胞经过雷帕霉素预处理后其形态很少发生改变，但3-MA预处理后细胞形态发生很大改变，表明自噬能保持细胞原有的形态。同时，低浓度雷帕霉素显著增加细胞活力，降低 NSE水平；3-MA显著降低细胞活力，升高NSE水平。　　2.在Aβ1-42作用之前用β-细辛醚预处理细胞其形态很少会发生改变，但单独用Aβ1-42处理细胞后其形态通常会发生改变，表明β-细辛醚能保持原有的细胞形态。此外，β-细辛醚可以显著升高细胞活力并降低 NSE水平。这些结果表明，通过预处理β-细辛醚可以保护细胞免受Aβ1-42诱导的细胞毒作用。我们还证实，Aβ1-42可以诱导自噬并且使Beclin-1的表达增加，而β-细辛醚可以显著减少Beclin-1的表达，表明β-细辛醚可以减轻Aβ1-42诱导的自噬。同时，预处理自噬抑制剂3-MA可以显著抑制Beclin-1的表达，但预处理自噬激活剂雷帕霉素可以显著增强的Beclin-1的表达。　　3.与正常对照组相比，Aβ组p-Akt和p-mTOR的水平显著下降。然而与Aβ组相比，β-细辛醚能显著增加p-Akt和p-mTOR的水平。PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂NVP-BEZ235显著降低p-Akt和p-mTOR的水平。同时，与正常对照组相比，Aβ或NVP-BEZ235组的Beclin-1的表达分别增加，但在β-细辛醚组显著降低。这些结果表明，β-细辛醚通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路减轻细胞自噬，这可能是β-细辛醚对抗Aβ毒性发挥神经保护作用的机制。　　4. Aβ1-42处理PC12细胞后出现[Ca2+]i升高，MMP降低。Aβ通过诱导细胞外Ca2+内流进入神经细胞的细胞质从而破坏神经细胞内Ca2+平衡，导致与Aβ相关的线粒体功能障碍和MMP下降。此时，自噬被诱导出来应对线粒体损伤和对抗Aβ诱导的细胞毒性。同时，在细胞应激发生前适度的调节自噬可以对抗Aβ诱导的细胞毒作用，调节Ca2+稳态，维持MMP。β-细辛醚可以降低钙离子浓度，提高MMP。　　结论：　　1. Aβ1-42的浓度对细胞存活率是一个重要因素，浓度越高，毒性越大。同时，随着时间的延长，细胞存活率逐渐下降。不同浓度的Aβ1-42和不同培养时间对 PC12细胞的存活率有不同的作用效果。Aβ1-42降低细胞活力具有剂量和时间依赖性。细胞活力与NSE水平呈负相关。在PC12细胞中，Aβ1-42可诱导Beclin-1介导的自噬，细胞活力和Beclin-1蛋白表达呈正相关。在损害发生之前，适度激活Beclin-1介导的自噬可以防止神经细胞死亡，而过度激活或抑制 Beclin-1介导的自噬可以加速细胞死亡。这些结果表明，在一定范围内适当激活Beclin-1介导的自噬可能有预防AD的作用。　　2.β-细辛醚可以减轻 Aβ1-42诱导的Beclin-1介导的自噬，使得自噬发生在适当的水平以发挥保护作用。低剂量的β-细辛醚作用效果更好，其原因可能是因为β-细辛醚为小分子脂溶性成分，是通过主动转运的方式通过细胞膜进入细胞从而发挥作用，随着浓度的增高β-细辛醚作用于细胞时存在高浓度饱和现象，相互间有竞争性抑制现象，所以可以通过调节β-细辛醚的浓度以达到最好的作用效果。　　3.β-细辛醚是通过PI3K-AKT-mTOR信号通路减轻Aβ诱导的自噬。β-细辛醚促进Akt的磷酸化，从而激活mTOR进一步促进mTOR的磷酸化，起到抑制自噬的作用。　　4.β-细辛醚可以适度的调节 Beclin-1介导的自噬，对抗 Aβ1-42诱导的毒性作用，调节Ca2+稳态和维持MMP，保护线粒体形态结构。