目的：乳腺癌是威胁女性生命和生活质量最严重的恶性肿瘤，其难以治愈的关键因素在于对各种化疗药物多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生。乳腺癌耐药蛋白BCRP(breast cancer resistant protein)是介导乳腺癌MDR重要的ABC转运蛋白，可特异性将其转运底物，如盐酸米托蒽醌(MX)等化疗药物，从细胞内泵到细胞外，从而产生耐药性。微小RNA(microRNA，miRNA)能够通过转录后调控(post-transcriptional regulation)的方式抑制目的基因的翻译和表达，目前，已有研究发现，一些miRNAs可以靶向作用于BCRPmRNA-3UTR，调控肿瘤细胞中BCRP的表达，因此，发现靶向作用BCRP的miRNAs对于逆转乳腺癌MDR具有重大意义。　　 课题组发现:BCRP不同表达的乳腺癌细胞中miR-181a的表达差异最为显著，但miR-181a是否通过靶向调节BCRP的表达从而逆转乳腺癌细胞的耐药性目前尚不清楚。为此，本研究选择与BCRP表达负相关的miR-181a作为研究对象，在乳腺癌药物敏感细胞MCF-7(BCRP低表达)和耐药细胞MCF-7/MX(BCRP高表达)中，分别构建miR-181a沉默表达和过表达的乳腺癌细胞模型，裸鼠皮下注射MCF-7/MX细胞，构建在体移植瘤模型，MX处理上述模型后，观察干预miR-181a表达后MX的敏感性、BCRP的表达及细胞内MX含量变化，分别在离体和在体水平探讨miRNA-181a对乳腺癌细胞耐药性的影响及可能机制，为研究乳腺癌耐药性形成与逆转的新切入点提供理论与实验依据。　　 实验方法：　　 采用microRNA微阵列芯片(microarrary)分析BCRP不同表达水平的乳腺癌细胞中miRNAs差异表达，并应用生物信息学进行分析预测，BCRPmRNA-3UTR中是否存在miR-181a调控BCRP表达的作用靶点，进一步通过荧光素酶报告基因分析证实miR-181a能否与BCRPmRNA-3UTR结合。采用脂质体转染法对人乳腺癌药物敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/MX进行转染，并采用乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX构建裸鼠移植瘤模型，瘤内注射miR-181a agmir诱导miR-181a过表达，采用qRT-PCR检测miRNA-181a的表达水平，确认细胞模型及裸鼠移植瘤模型是否构建成功;并采用qRT-PCR和Western blot检测肿瘤细胞和组织中BCRP，MRP，P-gp，LRP等耐药蛋白mRNA及蛋白表达水平，采用流式细胞仪检测细胞对药物的外排作用，MTT法检测MCF-7和MCF-7/MX细胞对MX的药物敏感性变化。　　 结果：　　 1.与MCF-7细胞相比，在MCF-7/MX细胞中MRP，P-gp，LRP和BCRP蛋白表达均有不同程度的升高，其中BCRP的表达升高最为明显(P＜0.05)。比较两细胞对BCRP特异性转运底物盐酸米托蒽醌(MX)药物敏感性的变化，我们发现MCF-7/MX细胞的耐药性（IC50=3.63±0.34μM），明显高于MCF-7细胞(IC50=0.52±0.05μM)(P＜0.05)。　　 2.采用microRNA微阵列芯片(microarrary)分析MCF-7/MX细胞(BCRP高表达)和MCF-7细胞(BCRP低表达)miRNAs差异表达，其中miR-181a表达下调最显著。同时，通过qPCR进一步验证，结果发现，与MCF-7细胞相比，MCF7/MX细胞中miR-181a表达明显降低(P＜0.05)，与microRNA微阵列芯片(microarrary)分析结果一致。　　 3.与阴性转染组(NC mimic与PGL3-BCRP3UTR共转染)比较，miR-181amimic与PGL3-BCRP3UTR共转染后，荧光素酶活性明显降低（P＜0.05）。miR-181amimic转染到MCF7/MX耐药细胞48h后，与阴性转染组相比，转染后导致原本miR-181a低表达的MCF-7/MX细胞中该miRNA的表达增加约100倍(P＜0.05)。同时，与阴性转染组相比，miR-181a过表达的MCF-7/MX细胞BCRPmRNA表达明显下降(P＜0.05)，BCRP蛋白表达亦明显下降(P＜0.05)。而MRP，P-gp，LRP等耐药蛋白的mRNA表达和蛋白水平均无明显改变（P＞0.05）。　　 4.与阴性转染组(NC mimic转染组)相比，miR-181a过表达的MCF-7/MX细胞内MX药物浓度明显增加(P＜0.05)。比较转染前后MCF-7/MX细胞对MX的敏感性的变化，空白对照组和阴性质粒转染组的IC50分别为3.63±0.34μM和3.86±0.36μM，两对照组间未见差异（P＞0.05），而诱导miR-181a过表达后MCF-7/MX细胞的IC50则仅为1.57±0.08μM，较对照组出现明显下降(P＜0.05);同时检测了miR-181a对依托泊苷(BCRP的非特异性转运底物)的药物敏感性的影响，结果发现，MCF-7/MX细胞转染miR-181amimic诱导miR-181a过表达后，与阴性转染组比较，依托泊苷的IC50值无明显改变（P＞0.05）。　　 5.瘤体内注射miR-181a agmir后miR-181a表达明显增加(P＜0.05)，进一步分析各组荷瘤鼠移植瘤生长表型的变化，其中，(1)盐酸米托蒽醌(MX)处理组与NC agmir转染组比较，瘤体积增加明显减慢(P＜0.05)，而同时瘤内注射转染miR-181aagmir联合MX给药组瘤体积明显小于单独MX处理组(P＜0.05);(2)未处理(UN)组与NC agmir转染组瘤组织重量无明显差异(分别为0.41±0.2g和0.49±0.17g);单独给予MX组瘤重量为0.37±0.13g，明显低于NC agmir转染组或未处理（UN）组(P＜0.05)，而miR-181a agmir瘤内注射转染联合MX给药组的瘤重仅为0.29±0.09g，明显低于MX单独处理组(P＜0.05)。　　 6.与NC agmir转染组相比，miR-181a agmir转染组的瘤组织中BCRPmRNA表达明显下降(P＜0.05)，BCRP蛋白表达亦明显下降(P＜0.05)。而MRP，P-gp，LRP等耐药蛋白的mRNA表达和蛋白水平均无明显改变（P＞0.05）。　　 7.MCF-7细胞在miR-181a inhibitor转染48h后，与阴性转染组(NC inhibitor转染组)相比，miR-181a的表达降低了5倍左右(P＜0.05)。同时，与阴性转染组相比，miR-181a低表达的MCF-7细胞中BCRPmRNA表达明显下降(P＜0.05)，BCRP蛋白表达亦明显增加(P＜0.05)。而MRP，P-gp，LRP等耐药蛋白的mRNA表达和蛋白水平均无明显改变（P＞0.05）。　　 8.与阴性转染组(NC inhibitor转染组)相比，miR-181a低表达的MCF-7细胞中MX药物浓度明显减少(P＜0.05)。比较转染前后MCF-7细胞对MX的敏感性的变化，miR-181ainhibitor转染后和阴性转染细胞的IC50值分别为2.04±0.08μM和0.56±0.05μM，转染组IC50值明显增加，对MX的药物敏感性下降(P＜0.05)。同时检测了miR-181a对依托泊苷的药物敏感性的影响，miR-181a inhibitor转染组与阴性转染组比较，依托泊苷的IC50值无明显改变(P＞0.05)。