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第一部分PEG化壳聚糖质粒纳米微粒的构建及其生物特性的检测目的:制备不同pH值的壳聚糖纳米粒及PEG化壳聚糖质粒纳米粒,研究PEG化壳聚糖纳米粒的特性及其对DNA的结合及保护能力。方法:采用离子交联法制备不同pH值的壳聚糖纳米粒,通过静电吸附作用连接上ACE基因特异性shRNA的干扰质粒;制备不同pH值的PEG化壳聚糖质粒纳米粒,并用喷金扫描电子显微镜检测,了解粒径的分布与形态;经琼脂糖凝胶电泳分析PEG化壳聚糖纳米载体与质粒DNA的结合能力以及不同pH值的PEG化壳聚糖纳米粒对质粒DNA的结合能力;用紫外分光光度计检测PEG化壳聚糖纳米粒对质粒的包封率;并通过DnaseⅠ消化PEG化壳聚糖纳米-质粒结合物以观察PEG化壳聚糖纳米载体对质粒的保护作用。结果:喷金扫描电镜检测证实PEG化壳聚糖纳米粒的粒径随溶液体系的pH值升高而增大,当pH值为5时其粒径呈均匀分散的球形颗粒,平均直径为5 nm;琼脂糖凝胶电泳的结果显示PEG化壳聚糖纳米粒能有效地结合质粒;不同pH值的PEG化壳聚糖纳米粒对质粒的保护作用不同,当pH值<7时PEG化壳聚糖纳米载体能100%结合质粒;DnaseⅠ消化试验证实PEG化壳聚糖纳米载体对质粒DNA有保护作用。结论:采用离子交联法制备出粒径较小、均匀的PEG化壳聚糖纳米粒,并且PEG化壳聚糖纳米粒能有效地连接上质粒并对其有保护作用。第二部分PEG化壳聚糖质粒纳米粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化目的:研究壳聚糖质粒纳米复合物与其经PEG修饰后对大鼠主动脉内皮细胞的转染效率。方法:采用贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,通过Ⅷ因子免疫荧光法对培养的细胞进行鉴定;选择生长良好的第3-4代细胞用于实验;分别用40ul、60ul、80ul、100ul、150ul壳聚糖质粒纳米复合物、经PEG(分子量为4000)修饰的壳聚糖质粒纳米复合物、经PEG(分子量为5000)修饰的壳聚糖质粒纳米复合物对内皮细胞转染。结果:经流式细胞仪检测,壳聚糖质粒纳米粒转染率为(26.0±3.9)%;经PEG修饰壳聚糖质粒纳米粒后转染效率最高的为取复合物量为100ul时,其转染率为(63.4±4.0)%,与其它量之间比较差异有统计学意义(P<0.05);并且经PEG4000与PEG5000修饰后的转染效率比较无显著差异(P>0.05); MTT结果显示PEG化壳聚糖质粒纳米粒转染后细胞存活率为(96.0±1.4)%,而没有经PEG化学修饰的壳聚糖质粒纳米粒转染后细胞存活率为(93.0±2.5)%。结论:经过优化转染条件,经PEG修饰后的壳聚糖质粒纳米复合物可以将重组质粒pACE-shRNA高效转染入大鼠血管内皮细胞,并保证较低的细胞毒性,作为我们下一步实验的最优选择。第三部分PEG化壳聚糖纳米粒质粒复合物转染细胞后ACEmRNA表达的研究目的:研究经PEG修饰的壳聚糖质粒纳米复合物对大鼠主动脉内皮细胞ACE mRNA表达水平的影响。方法:将实验分为空白对照组;质粒对照组;转染PEG化壳聚糖纳米质粒复合物组;采用实时荧光定量-PCR技术测定细胞中ACE mRNA(24h、48h、72h)的表达。结果:转染PEG化壳聚糖质粒纳米复合物后24小时细胞ACE mRNA表达水平下降了(14.7±5.9)%,48小时为(53.6±5.4)%,72小时为(60.1±2.1)%。在48h时质粒对照组细胞的ACE mRNA表达水平下降了(0.6±0.3)%,与PEG化壳聚糖质粒纳米复合物组相比有统计学差异(均P﹤0.05)。结论:成功利用PEG化壳聚糖纳米粒质粒复合物转染大鼠主动脉内皮细胞,并沉默目的基因。