研究背景：　　 鼻咽癌是高发于中国南方的恶性肿瘤之一。生物学行为上,鼻咽癌较之头颈部其它恶性肿瘤有更容易出现早期组织侵袭和淋巴结转移,因此预后较差。临床上,常根据TNM分期来预测鼻咽癌患者的预后,但我们发现,TNM分期相同的不同鼻咽癌患者,即使接受同样的放疗和化疗方案,也常常表现出不同的临床后果。那么,是否存在某种机制,参与鼻咽癌的发展演进过程,从而影响其临床预后?但目前研究尚未得到明确的结论。在病理组织形态上,鼻咽癌高发区的主要组织学类型为未分化型非角化性癌,其特点是癌组织中常有较多淋巴类细胞浸润,这种炎症样的微环境是鼻咽癌的一个显著组织学特征。目前的研究表明,慢性炎症的微环境不仅是肿瘤的始动因素,还参与促进了肿瘤的生长、肿瘤血管形成、侵袭和转移。这些功能是通过肿瘤间质细胞分泌的炎症介质而发挥作用的。已有文献报道某些细胞因子和化学因子具有影响肿瘤进展的潜能,提示这些分子(因子)对肿瘤预后发挥着重要作用。　　 鼻咽癌组织中常有较多淋巴类细胞浸润,而巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和IL-8均可由这些细胞分泌,癌细胞本身也可分泌这些细胞因子；鼻咽癌易早期侵袭转移是否与这些因子有关?这是值得探讨的问题。而在肿瘤的侵袭转移过程中,肿瘤细胞之间同质黏附力的下降和肿瘤细胞与细胞外基质之间异质黏附力的增强有助于肿瘤脱离原发灶而发生迁移。因此细胞黏附分子的作用功不可没。同时,肿瘤血管的生成除了为肿瘤组织提供氧气也营养成分,促进肿瘤细胞生长之外,也有助于瘤细胞发生远处转移。　　 MIF可由多种组织细胞分泌,传统上认为它是一种T淋巴细胞源性的细胞因子,而巨噬细胞则是MIF主要的靶细胞。以往对MIF的研究多集中于其在感染、迟发型变态反应、损伤修复等过程中的作用,近十年来的研究提示多种肿瘤中MIF过表达；MIF可能具有刺激肿瘤细胞增殖、分化以及抑制肿瘤细胞凋亡的潜能,其机制可能是通过促进肿瘤血管生成、参与信号传导和细胞周期的作用、抑制p53的活性、参与肿瘤免疫等。　　 作为已知的可能具有促进肿瘤细胞生长增殖、侵袭和转移潜能的细胞因子MIF,在鼻咽癌的侵袭转移中,发挥了何种作用,是否影响了其它细胞因子比如IL-8的分泌、参与癌组织肿瘤性血管生成、影响了细胞黏附分子E-cadherin(E-cad)和CD44v6的功能,而且其作用机制如何?据目前掌握的资料,国内外关于鼻咽癌侵袭转移过程中MIF与IL-8、E-cad、CD44v6的关系的研究并不多见。　　 研究内容:　　 本论文采用141例鼻咽癌高发区的未分化型非角化性鼻咽癌和分化型非角化性鼻咽癌组织标本,制作组织芯片,利用组织芯片的大规模、高通量和标准化的优点,进行免疫组化染色,检测细胞因子MIF和IL-8、细胞黏附分子E-cad(介导同质黏附)和CD44v6(介导介质黏附)蛋白表达,以及通过CD34的表达检测肿瘤内微血管密度,分析这些侵袭转移相关因素与鼻咽癌组织各项临床病理特征的关系、以及这些因素之间的关系,探讨其作用机制。同时,本研究采用细胞培养方法培养鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2,用重组人MIF细胞因子分别外源性刺激这两株细胞,与未经MIF刺激的细胞相比较,通过ELISA、免疫细胞化学方法和蛋白印迹等方法,检测培养液上清中IL-8的浓度、E-cad和CD44v6蛋白的表达情况,研究MIF细胞因子和IL-8、E—cad、CD44v6蛋白表达之间的关系,探讨MIF促进鼻咽癌细胞侵袭转移的机制。并且,进行MIF基因克隆及其真核表达载体pcDNA3.1-MIF的构建并稳定转染鼻咽癌细胞,建立稳定过表达MIF的鼻咽癌细胞系,用以后续研究。　　 我们的目的是通过组织学、细胞学的研究以及对患者生存预后的分析,明确MIF在鼻咽癌中的表达是否影响癌细胞的侵袭转移行为以及通过何种机制进行调控；在诸多与MIF因子相关的因素中,哪一个才是能够真正评估鼻咽癌患者预后的独立影响因子。　　 全文共分为三章:　　 第一章MIF蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其意义　　 目的:检测MIF蛋白在鼻咽癌组织中的表达,及其与IL-8,E-cad,CD44v6蛋白表达、微血管密度及临床病理特征的关系。　　 方法:　　 1.收集诊断明确未经治疗的鼻咽癌病例141例,活检组织标本均用福尔马林固定、石蜡包埋组织并进行组织切片和HE染色。　　 2.组织蜡块制作组织芯片,并进行组织切片和HE染色。　　 3.采用免疫组化方法,使用DAKO加强试剂盒(ChemMateTMEnvision+/HRP,GK500705,DAKO),在组织芯片上检测鼻咽癌组织中癌细胞及间质细胞MIF、IL-8、E-cad、CD44v6蛋白表达,用CD34显示血管生成情况。分析各蛋白之间及其与微血管密度、鼻咽癌临床病理特征的关系。　　 4.使用EB病毒探针原位杂交试剂盒(Epstein-Barr Virus Probe ISH Kit)在组织芯片上进行原位杂交实验,检测鼻咽癌组织中EBERs的表达情况。　　 结果:　　 1.组织芯片包括141例NPC组织,其中男性92例(65.25％),女性49例(34.75％),年龄范围25—76岁,中位年龄51岁；肿瘤T分期T1-2有60例,T3—4有81例；伴淋巴结转移103例,不伴淋巴结转移38例:临床分期早期(Ⅰ-Ⅱ期)47例,晚期(Ⅲ—Ⅳ期)94例；组织学类型中分化型非角化性癌(DNKC)19例,未分化型非角化性癌(UCNT)122例,无角化性癌。　　 2.免疫组化表明:MIF蛋白阳性信号位于癌细胞和部分淋巴细胞的胞浆,141例鼻咽癌组织中MIF蛋白高表达率为69.50％(98/141)。MIF蛋白表达与鼻咽癌淋巴结转移、临床分期有统计学相关性；与微血管密度、患者存活率有统计学相关性；与IL-8、E-cad、CD44v6蛋白表达均相关。　　 3.免疫组化显示:鼻咽癌组织IL-8蛋白表达与鼻咽癌组织学类型、患者存活率、微血管密度有统计学相关性；E-cad蛋白表达与淋巴结转移、临床分期、患者存活有统计学相关性。鼻咽癌组织微血管密度与肿瘤大小、MIF、IL-8蛋白表达有统计学相关性。患者存活率与淋巴结转移、临床分期有统计学相关性。　　 4.淋巴结转移、E-cad蛋白表达、微血管密度分别与鼻咽癌患者预后有独立的统计学相关性。　　 5.本组141例鼻咽癌组织原位杂交显示EBERs表达阳性率为100％(141/141),阳性信号位于癌细胞胞核。　　 结论:　　 1.MIF在鼻咽癌侵袭转移中起一定作用,其作用可能与MIF对IL-8、E-cad、CD44v6和肿瘤血管生成的影响有关。　　 2.淋巴结转移、E-cad蛋白表达、微血管密度分别是鼻咽癌患者预后的独立因素。　　 第二章外源性MIF刺激鼻咽癌细胞后IL-8、E-cad、CD44v6的表达变化　　 目的:在细胞学中研究外源性MIF细胞因子对鼻咽癌侵袭转移的作用。　　 方法:　　 1.常规培养鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2。　　 2.CNE-1和CNE-2两株细胞分别给予不同浓度的重组人MIF细胞因子(MIF终浓度分别为25,50,100ng/ml),刺激24小时和48小时后,分别收集各组细胞培养上清,用ELISA方法检测培养上清中的IL-8浓度。　　 3.分别收集经终浓度为25ng/ml的MIF细胞因子刺激24小时后的CNE-1和CNE-2细胞,一方面行免疫细胞组化榆测E-cad和CD44v6蛋白的表达,一方面提取细胞蛋白并进行蛋白印迹检测E-cad和CD44v6蛋白的表达。　　 4.两株细胞均抽提DNA,进行EB病毒W片段PCR扩增。　　 结果:　　 1.外源性细胞因子MIF刺激后,CNE-1和CNE-2细胞株培养上清中IL-8浓度均明显上升,且随MIF浓度的增多而升高,MIF浓度为100ng/ml时CNE-1细胞株的IL-8分泌进入平台期,而MIF浓度为50ng/ml时CNE-2细胞株的IL-8分泌进入平台期。　　 2.免疫细胞化学中,可见外源性MIF刺激前CNE-1细胞常规培养时,E-cad蛋白表达于细胞膜,MIF刺激后细胞离散,E-cad表达降低且阳性信号位于细胞浆(胞内化、异常表达)；外源性MIF刺激后,CNE-2细胞较常规培养时呈梭形变,且细胞的CD44v6蛋白表达增强。Western—blot结果也显示,外源性MIF刺激后,CNE-1细胞E-cad蛋白表达明显下降,CNE-2细胞CD44v6蛋白表达明显增强。　　 3.PCR结果证实:CNE-1和CNE-2均为EB病毒感染阴性株。　　 结论:　　 1.MIF因子具有体外上调鼻咽癌细胞IL-8和CD44v6蛋白表达的能力,并下调E—cad蛋白表达,可能由此促进鼻咽癌细胞的侵袭转移。　　 2.MIF上调IL-8、CD44v6和下调E-cad蛋白表达是EBV非依赖性的。　　 3.MIF可能诱导鼻咽癌细胞发生上皮-间质细胞转化(EMT)。　　 第三章MIF基因真核表达载体的构建和稳定转染鼻咽癌细胞　　 目的:建立MIF基因真核表达载体和稳定性过表达MIF的鼻咽癌细胞。　　 方法:　　 1.MTF基因克隆及其真核表达载体PcDNA3.1-MIF的构建　　 应用RT-PCR方法扩增鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2的cDNA片段；将上述PCR纯化产物及载体质粒pcDNA3.1分别用EcoRI和BamHI双酶切；连接载体与目的片段,并转化感受态细胞。对阳性克隆进行测序。　　 2.pcDNA3.1-MIF重组质粒稳定转染鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2　　 采用Lipofectamine2000转染试剂,转染鼻咽癌细胞,转染第二天加入G418筛选抗性细胞,以后每3天更换培养基和G418,培养10—14天后,改用维持量G418继续筛选,维持4周后,筛选阳性细胞克隆,进行Western-blot检测MIF蛋白的表达。　　 结果:　　 1.测序结果表明成功构建pcDNA3.1-MIF重组质粒。　　 2.Western-blot表明pcDNA3.1-MIF重组质粒稳定转染的CNE-2细胞的MIF蛋白表达水平高于转染pcDNA3.1空质粒的对照组细胞。成功建立稳定过表达MIF的鼻咽癌细胞系。　　 结论:　　 pcDNA3.1-MIF重组质粒稳定转染的细胞能有效地过表达MIF。　　 全文小结　　 MIF在鼻咽癌中可能通过上调IL-8的表达、促进肿瘤血管生成以及影响细胞黏附分子的表达,包括影响介导同质黏附的E-cad和介导异质黏附的CD44v6的表达,从而促进癌细胞侵袭转移的能力。　　 我们构建了MIF基因真核表达载体并稳定转染鼻咽癌细胞,可用于进一步深入探讨MIF与鼻咽癌侵袭转移的关系。