目的:　　无机砷及其化合物是国际癌症研究机构(IARC)确认的人类致癌物，据美国国家科学研究委员会(NRC)统计，全球受高砷暴露威胁的人口可达2亿人。近年来慢性饮水砷中毒引起免疫系统功能的损伤逐渐成为研究的热点，大量的流行病学数据和动物实验表明，环境砷暴露可以影响机体免疫器官的发育，破坏免疫器官的正常结构等，最终导致机体的免疫监视功能低下，为实质器官肿瘤的发生提供了有利条件。因此探索无机砷暴露如何诱导免疫毒性，不仅可以为无机砷远期致癌机制提供新的理论线索和靶点，也为临床上推广砷及其化合物治疗自身性免疫疾病提供理论基础和新的治疗思路。　　树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是机体特异性免疫应答的始动者，对于维持正常机体免疫系统的自身稳态方面发挥重要作用。当DCs表型和功能出现紊乱时，就会影响幼稚T淋巴细胞的增殖分化，从而削弱机体正常的免疫监视功能，诱发机体免疫无应答和免疫抑制现象的发生，为肿瘤的发生发展提供可乘之机。砷对免疫系统的损伤已经成为研究的热点，然而砷如何通过影响DCs的表型和功能，改变幼稚T淋巴细胞的增殖分化，最终介导免疫毒性以及详细的机制如何，查阅国内外有关文献，我们虽然得到启发但这些问题并未阐明。因此本研究第一部分以小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrowdendritic cells，BMDCs)为研究对象，观察无机砷暴露如何影响BMDCs表型受体（协同刺激分子、抗原提呈分子和趋化粘附因子）、细胞因子和炎性通路(NF-κB和MAPKs)的表达，以及混合淋巴细胞共培养后淋巴细胞的增殖分化，从而系统性阐明无机砷对BMDCs表型和功能的影响。　　最新研究发现，核转录因子NRF2通路除了发挥其经典的抗氧化作用以外，还能抑制炎症信号级联反应，间接调控机体的免疫应答，从而维持机体的内环境稳态。无机砷强烈诱导NRF2信号通路活化已经在人永生化表皮角质细胞HaCaT、膀胱上皮细胞UROtsa和巨噬细胞RAW264.7等细胞系中报道，然而关于无机砷能否通过引起DCs中NRF2信号通路的活化，进而调控DCs表型受体、细胞因子以及炎性通路表达的研究却很少报道。SQSTM1/p62(Sequestosome1，SQSTM1)是一个能结合泛素的适配蛋白，在自噬和蛋白酶体依赖的细胞降解中发挥重要功能。最新的研究表明，p62的KIR序列能够与NRF2竞争性的结合Keap1，进而降低Keap1与NRF2的亲和力，使NRF2信号通路被激活。因此，本研究第二部分通过建立体外BMDCs细胞NRF2信号通路活化模型，观察无机砷对NRF2信号通路的效应情况，并且探讨核转录因子NRF2通路在调控BMDCs表型受体、细胞因子以及炎性通路表达中的可能作用。另外，通过对BMDCs自噬流相关蛋白的检测，探讨无机砷是否通过p62-Keap1途径激活NRF2信号通路，从而在无机砷介导BMDCs免疫毒性中发挥作用。　　核转录因子NRF2通路作用的发挥，往往与其下游调控的一系列抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达密切相关。血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）作为NRF2下游调控的Ⅱ相解毒酶，不仅在抗氧化方面发挥重要的作用，而且在抑制免疫反应和诱导免疫耐受方面发挥重要作用。除此之外，HO-1通过催化血红素反应产生的代谢产物CO也具有抗炎症、抗凋亡、舒张血管等组织保护作用。因此，本研究第三部分通过对HO-1/CO系统进行特异性干预后，观察无机砷诱导的HO-1/CO系统活化对BMDCs表型受体、细胞因子和炎性通路表达的影响，进一步探索HO/CO系统在无机砷介导的BMDCs免疫毒性中的可能作用。　　综上所述，本研究以亚砷酸钠为暴露因素，建立C57BL/6小鼠急性砷染毒动物模型和原代诱导培养的小鼠BMDCs体外染毒模型，通过观察无机砷对BMDCs表型受体、细胞因子和炎性通路的影响，以及核转录因子NRF2及其下游的HO-1/CO系统在无机砷介导BMDCs免疫毒性中的可能作用，从而使我们更深层次的了解无机砷的免疫毒性作用，为研究无机砷远期致癌机制提供新的理论线索和靶点，以及临床上推广砷及其化合物治疗自身性免疫疾病提供理论基础和新的治疗思路。　　研究方法:　　本研究以C57BL/6小鼠和体外诱导培养的BMDCs为研究对象，通过体内体外无机砷染毒以及不同的干预措施，观察和探究无机砷对BMDCs表型受体、细胞因子和炎性通路的影响，以及核转录因子NRF2及其下游的HO-1/CO系统在无机砷诱导BMDCs免疫毒性中的作用，具体研究方法如下:　　1.BMDCs细胞活力测定:　　收集BMDCs并计数细胞，根据实验分组配制染毒液。AsⅢ染毒2h后终浓度为25 ng/ml的LPS刺激树突状细胞成熟，24 h后每孔100μl培养基加20μl MTS试剂，37℃，5％ CO2的环境下孵育1-4 h。于全波长酶标仪490 nm下读取吸光度值。　　2.BMDCs表型受体的流式检测:　　收集急性砷暴露C57BL/6小鼠的脾脏单细胞悬液或者BMDCs单细胞悬液到15ml离心管中，细胞计数并且调整细胞浓度，按照流式抗体说明书的比例加入相应流式抗体进行双标实验，室温避光孵育40 min后用stain buffer重悬离心重复2次后，BD LSRFortessa型流式仪器上机检测。　　3.Real-time PCR分析基因转录活性　　应用Trizol法提取BMDCs总mRNA，利用GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。GoTaq(@)qPCR Master Mix试剂盒被用于实时定量PCR分析。采用ABI PRISM7500 Sequence Detector(AppliedBiosystems)进行检测后，进行数据的统计分析。　　4.C57BL/6小鼠血清及BMDCs上清液细胞因子ELISA测定:　　按照eBioscience试剂盒说明书进行检测，提前一天包被抗体，4℃过夜，按照说明书经1 x ELISAPOT进行阻断，用1 x ELISAPOT倍比稀释液稀释标准蛋白，同时加入解冻的样本100μl/孔，封板，室温孵育2h。洗板3-5次，每孔加入100μlAvidin-HRP，封板，室温孵育30 min。洗板3-5次，加入100μl1 x TMB substratesolution，室温避光孵育15 min。洗板3-5次，加入50μl ELISA终止液，450 nm波长读数，分析数据。　　5.单向混合淋巴细胞共培养淋巴细胞增殖活力和细胞分型测定:　　BMDCs与脾脏淋巴细胞按照比例进行混合，于5％ CO2的环境下继续孵育48h后，加入20μl MTS试剂，37℃，5％ CO2的环境下孵育1-4h，全波长酶标仪490 nm下读取吸光度值，判定淋巴细胞增殖活力。　　BMDCs与脾脏淋巴细胞按照1∶10比例进行混合，于37℃、5％CO2的环境下继续孵育48 h，收集细胞离心并用PBS洗2次后，再次离心加入100μl抗体稀释液，同时按照流式抗体说明书比例加入相应的流式抗体，于室温避光孵育40 min后，离心反复洗两次后加入350μl抗体稀释液上机检测，判定淋巴细胞细胞分型。　　6.Western blot免疫印迹检测蛋白表达:　　按照论文中Western blot技术的详细步骤，提取BMDCs蛋白后测定蛋白浓度，然后调节蛋白的上样量，依次经过配制凝胶、western blot电泳、转膜、非特异性蛋白阻断、一抗过夜和二抗孵育后，进行ECL发光检测NF-κB p65、p-IκB/IκB、Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK、NRF2、HO-1、GCLM、LC3 A/B、SQSTM1/p62、Keap1、LAMP2等蛋白的表达水平。　　7.统计学分析　　应用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，结果表示为Mean±SD，采用单因素方差分析进行多组间差异的显著性检验;进一步两组间比较采用LSD-t检验(Fisher,s least significant difference t-test)，以p＜0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1.无机砷抑制BMDCs表型受体的表达　　1μM AsⅢ染毒的BMDCs表面的突起较短，而且成熟度较高的BMDCs比例较少;非毒性浓度的无机砷剂量依赖性的抑制了LPS促成熟的BMDCs协同刺激分子(CD83、CD86、CD80和CD40)、抗原提呈分子MHCⅡ以及趋化粘附因子(CCR7、CCR5和ICAM-1)的表达，且差异均有统计学意义(p＜0.05);体内无机砷染毒小鼠脾脏中BMDCs数量减少，并且MHCⅡ表达降低。　　2.无机砷抑制BMDCs细胞因子的表达　　非毒性浓度的AsⅢ剂量依赖性的抑制BMDCs前炎症因子（TNF-α和IL-1β）、Th1诱导型细胞因子(IL-12)、Th17诱导型细胞因子（IL-6和IL-23）蛋白表达和基因转录活性，且差异均有统计学意义(p＜0.05);上调Treg诱导型细胞因子(IL-10)蛋白表达和转录活性的增加，且差异均有统计学意义(p＜0.05);抑制BMDCs介导的单向混合淋巴细胞的增殖能力，并且下调CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的升高，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。　　3.无机砷抑制BMDCs炎症通路NF-κB和MAPKs的活化　　非毒性浓度的AsⅢ剂量依赖性的抑制了BMDCs细胞NF-κB p65、p-IκB/IκB以及上游Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK表达，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。　　4.无机砷诱导BMDCs核转录因子NRF2通路活化　　非毒性浓度的AsⅢ剂量依赖性的上调NRF2和HO-1蛋白表达和基因转录活性的升高，且差异均有统计学意义(p＜0.05);　　5.无机砷和NRF2诱导剂tBHQ诱导BMDCs核转录因子NRF2通路活化　　1μM AsⅢ和10μM tBHQ明显诱导NRF2、GCLM和HO-1蛋白表达的明显升高和Keap1表达的明显降低，以及Gclc、Gclm和Hmox1转录水平明显上升，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。　　6.HO-1诱导剂CoPP和CO释放分子CORM-2诱导BMDCs细胞HO-1蛋白表达和转录活性增加　　CoPP明显诱导HO-1蛋白的表达和转录活性的增加，与COPP的作用相比，20μM和40μM CORM-2轻微上调了HO-1蛋白的表达和转录活性，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。　　7.无机砷诱导的NRF2通路和HO-1/CO系统活化抑制BMDCs表型受体和细胞因子的表达　　tBHQ、COPP和CORM-2明显抑制了BMDCs协同刺激分子(CD83、CD86、CD80和CD40)、趋化粘附因子（CCR7、CCR5和ICAM-1）、炎性因子（TNF-α和IL-1β）、Th1诱导型细胞因子(IL-12)和Th17诱导型细胞因子（IL-6和IL-23）蛋白表达或基因转录活性的升高，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。　　8.无机砷诱导的NRF2通路和HO-1/CO系统活化抑制BMDCs炎症通路NF-κB和MAPKs的活化　　与对照组相比，tBHQ、COPP和CORM-2抑制了NF-κB p65、p-IκB/IκB以及上游Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表达，且差异均有统计学意义(p＜0.05)　　9.无机砷诱导BMDCs自噬溶酶体形成障碍的产生，并通过p62-Keap1依途径诱导核转录因子NRF2通路活化　　不同浓度的无机砷剂量依赖性的抑制Keap1和LAMP2的表达，而诱导了自噬信号通路相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的升高，且差异均有统计学意义(p＜0.05)。1μM AsⅢ染毒的树突状细胞中可见大量自噬体积累，但并未观察到溶酶体和自噬溶酶体的存在。　　10.HO-1抑制剂ZnPP抑制无机砷诱导的BMDCs细胞HO-1蛋白表达　　不同浓度的ZnPP在6h和12h都可以剂量依赖性的抑制无机砷诱导的HO-1蛋白的表达，且差异均有统计学意义(p＜0.05)，但对Hmox1的转录活性影响不明显。　　11.HO-1/CO系统低表达部分缓解无机砷对BMDCs表型受体和细胞因子转录活性的抑制作用　　1μM AsⅢ抑制了趋化因子Ccr7、前炎症因子Tnf和Th17诱导型细胞因子Il-6和Il-23转录活性，然而ZnPP可以剂量依赖性的缓解无机砷对BMDCs趋化因子Ccr7、前炎症因子Tnf-α和Th17诱导型细胞因子Il-6和Il-23转录活性的抑制，且差异均具有统计学意义(p＜0.05)。　　结论:　　1)无机砷通过抑制BMDCs表型受体（协同刺激分子、趋化粘附因子）、细胞因子（前炎症因子、Th1和Th17诱导型细胞因子）和免疫相关通路(NF-κB和MAPKs)的表达，而特异性的增强Treg型细胞因子IL-10的表达，最终诱导BMDCs免疫耐受性。　　2)无机砷通过诱导核转录因子NRF2信号通路的活化，抑制BMDCs表型受体、细胞因子和免疫相关通路的表达，最终诱导BMDCs免疫耐受性。　　3)无机砷诱导BMDCs的NRF2信号通路活化，可能与BMDCs自噬溶酶体形成障碍导致的SQSTM1/p62大量堆积有关。　　4)无机砷诱导核转录因子NRF2下游HO-1/CO系统的活化，特异性的抑制BMDCs趋化粘附因子CCR7、前炎症因子TNF-α以及Th17诱导型细胞因子IL-6和IL-23的表达，部分诱导了BMDCs免疫耐受性。