第一部分甘草酸对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响目的:探讨甘草酸(GA)对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响及其可能作用机制。方法:通过建立支气管哮喘小鼠动物模型,以25、50、100 mg/kg三种不同浓度的GA进行干预,末次激发后24 h采用动物肺功能仪对各组小鼠的气道反应性进行测定;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),离心后计数细胞总数及白细胞分类数量;ELISA法检测各组小鼠血浆总Ig E、OVA-特异Ig E水平和BALF上清液中IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平;肺组织HE染色;免疫组化法检测肺组织中趋化因子Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表达。结果:(1)哮喘组小鼠具有典型的哮喘发作样症状,各浓度GA干预组小鼠上述反应较轻。(2)各组小鼠肺阻力(RL)和肺顺应性(Cdyn)基础值相近,肺阻力随着激发液乙酰甲胆碱剂量的升高而增加,而肺顺应性则随着激发液乙酰甲胆碱剂量的升高而降低;在同等剂量乙酰甲胆碱(0.050、0.100、0.200 mg/kg)激发时,哮喘组小鼠RL显著高于对照组,而肺Cdyn显著低于对照组(均P<0.05);在乙酰甲胆碱剂量分别为0.100、0.200 mg/kg激发时,中、高浓度GA组的RL显著低于哮喘组,而肺Cdyn显著高于哮喘组(均P<0.05)。(3)哮喘组小鼠血浆总Ig E、OVA-特异Ig E水平均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);GA干预组血浆Ig E、OVA-特异Ig E水平低于哮喘组,且在中、高浓度干预组中尤其明显(均P<0.05)。(4)哮喘组BALF中细胞总数及Eos、Lym和Neu计数均高于对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.05);高浓度GA干预组BALF中细胞总数及Eos、Lym和Neu计数均低于哮喘组(P值均<0.05)。(5)哮喘组BALF中IL-12p70水平低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);中、高浓度GA干预组BALF中IL-12p70水平均显著高于哮喘组(均P<0.05)。哮喘组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);中、高浓度GA干预组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平低于哮喘组(均P<0.05)。哮喘组BALF中IL-10的水平高于对照组(t=3.373,P<0.05),各浓度GA干预组BALF中IL-10水平显著高于哮喘组(组间F值为54.187,P<0.05);哮喘组小鼠BALF中IFN-γ水平显著低于对照组(t=4.971,P<0.05),中、高浓度GA干预组小鼠BALF中IFN-γ的水平显著高于哮喘组(均P<0.05);哮喘组BALF中IFN-γ/IL-4比值显著低于对照组(t=6.943,P<0.05),中、高浓度GA干预组IFN-γ/IL-4比值均显著高于哮喘组(组间F值为17.533,P<0.05)。(6)哮喘组小鼠气道黏膜充血水肿,气道壁及管周有大量以Eos为主的炎症细胞浸润,各GA组气道炎症反应较哮喘组轻,在中、高浓度GA组尤其明显。(7)哮喘组Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表达均高于对照组(均P<0.05),中、高浓度GA干预组小鼠Eotaxin、MCP-1和CINC-1蛋白的表达低于哮喘组(均P<0.05)。结论:(1)GA能够降低哮喘小鼠的气道高反应性,减少BALF中细胞总数和Eos、Lym和Neu分类计数,降低血浆总Ig E、OVA-特异Ig E水平,增加哮喘小鼠BALF中IL-10、IL-12p70和IFN-γ水平,降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量;(2)GA可以下调哮喘组小鼠肺组织中趋化因子Eotaxin、MCP-1和CINC-1的表达;(3)GA可能通过影响Th1/Th2平衡,减轻哮喘气道炎症。第二部分甘草酸对支气管哮喘小鼠OX40/OX40L/p38 MAPK信号通路的影响目的:探讨甘草酸(GA)对支气管哮喘小鼠OX40/OX40L/p38 MAPK信号通路的影响。方法:(实验一)第一部分支气管哮喘小鼠模型实验分组,RT-PCR法检测肺OX40、OX40L的m RNA表达;流式细胞术检测哮喘小鼠脾脏CD11c+树突细胞(DCs)表面CD86、MHC-Ⅱ、CD40和OX40L的表达、T细胞表面OX40和B细胞、单核细胞表面OX40L的表达情况;免疫组化法检测肺组织中OX40、OX40L、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的蛋白表达;Western Blotting法检测肺组织p38MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表达。(实验二)建立支气管哮喘小鼠动物模型,分别采用100 mg/kg浓度GA、抗OX40L m Ab和p38 MAPK抑制剂SB203580干预,并设立正常对照组、哮喘组、同型对照Ig G2b组和载体DMSO组,观察小鼠症状、气道反应性测定、BALF细胞总数及白细胞分类计数;ELISA法检测各组小鼠血浆总Ig E、OVA-特异Ig E水平和BALF上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平;肺组织HE染色;免疫组化法检测肺组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表达;Western Blotting法检测肺组织p38 MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表达。结果:(实验一)(1)哮喘组小鼠肺组织OX40和OX40L的m RNA表达高于对照组(均P<0.05),各浓度GA干预组小鼠肺组织OX40和OX40L的m RNA相对灰度值低于哮喘组,呈浓度依赖趋势(均P<0.05)。(2)哮喘组小鼠脾脏CD11c+DCs表面CD86、MHC-Ⅱ、CD40和OX40L分子的表达明显高于正常对照组(均P<0.05),经GA干预后MHC-Ⅱ、CD40和OX40L分子的表达均有不同程度的下降,呈浓度依赖趋势(均P<0.05)。(3)哮喘组小鼠脾脏CD4+OX40+、CD19+OX40L+、CD11b+OX40L+较正常对照组明显增高(均P<0.05),GA干预组小鼠脾脏CD4+OX40+、CD19+OX40L+、CD11b+OX40L+表达均低于哮喘组,在中、高浓度GA组中作用尤其明显,差异有统计学意义(均P<0.05)。(4)免疫组化分析,哮喘组小鼠肺组织OX40、OX40L和p-p38 MAPK的表达均高于对照组(均P<0.05),GA干预组小鼠肺组织OX40、OX40L和p-p38 MAPK蛋白的表达低于哮喘组,此作用在中、高浓度GA组中尤其明显,差异有统计学意义(均P<0.05)(5)Western Blotting法检测,哮喘组小鼠肺组织p-p38 MAPK的蛋白表达高于对照组(P<0.05),GA干预组小鼠肺组织p-p38 MAPK蛋白的表达低于哮喘组,此抑制作用在中、高浓度GA组中尤其明显(均P<0.05)。(实验二)(1)哮喘组小鼠具有典型的哮喘发作样症状,各药物干预组小鼠上述反应较轻。(2)在乙酰甲胆碱剂量分别为0.050、0.100、0.200 mg/kg激发时,GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组的RL显著低于哮喘组(均P<0.05),而肺Cdyn显著高于哮喘组(均P<0.05)。(3)GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组血浆Ig E、OVA-特异Ig E水平低于哮喘组(均P<0.05)。(4)GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组BALF中细胞总数及Eos、Lym和Neu计数均低于哮喘组(均P<0.05)。(5)GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平低于哮喘组(均P<0.05),而BALF中IFN-γ的水平显著高于哮喘组,差异有统计学意义(均P<0.05)。(6)GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组较哮喘组相比,气道黏膜充血水肿减轻,气道壁及管周炎症细胞浸润减少。(7)免疫组化分析,GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组肺组织p-p38 MAPK蛋白的表达明显低于哮喘组(均P<0.05),各组之间p38 MAPK蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。(8)Western Blotting法检测,GA组、抗OX40L m Ab组和SB203580组肺组织p-p38 MAPK蛋白的表达明显低于哮喘组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:(1)GA可以抑制哮喘小鼠肺组织OX40和OX40L的m RNA表达,削弱哮喘小鼠肺组织和脾脏OX40和OX40L的蛋白表达,此抑制作用呈浓度依赖趋势;(2)GA可以影响DCs表面MHC-Ⅱ、CD40和OX40L分子的表达;(3)高浓度GA、抗OX40L m Ab和p38 MAPK抑制剂(SB203580)均可以缓解哮喘发作样症状,降低哮喘小鼠的气道高反应性,减少BALF中细胞总数和Eos、Lym和Neu分类计数,降低血浆总Ig E、OVA-特异Ig E水平,增加哮喘小鼠BALF中IFN-γ水平,降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量,减轻肺部炎症细胞浸润;(4)高浓度GA、抗OX40L m Ab和SB203580可以抑制哮喘小鼠肺组织p-p38 MAPK的蛋白表达;(5)GA可能通过抑制OX40/OX40L/MAPK信号通路活化,调节Th1/Th2平衡,从而减轻哮喘气道炎症反应。第三部分甘草酸对支气管哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞增殖和OX40/OX40L/p38 MAPK信号通路的影响目的:探讨甘草酸(GA)对支气管哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞增殖和OX40/OX40L/p38 MAPK信号通路的影响。方法:通过磁珠分选建立支气管哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞体外培养体系,分别以anti-CD3 m Ab(1μg/ml)和anti-OX40 m Ab(2.5μg/ml)刺激后,以不同浓度的GA或p38 MAPK抑制剂SB203580(10μM)进行干预,同时以Ig G或DMSO作为对照,培养72 h后,运用CCK8法检测哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞的增殖能力;运用ELISA法检测CD4+T细胞培养上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量;同时运用Western Blotting法检测CD4+T细胞p38 MAPK、p-p38 MAPK的蛋白表达水平。结果:(1)支气管哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞经anti-CD3 m Ab处理后,OD值较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.01);三种不同浓度的GA干预后,其OD值较CD3组下降,其中浓度为10μg/ml和100μg/ml的GA组尤著,差异有统计学意义(均P<0.01);支气管哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞经anti-CD3 m Ab激发后,再以anti-OX40 m Ab(2.5μg/ml)处理,其增殖能力明显提高,CD3+OX40组OD值较CD3+Ig G组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);三种不同浓度的GA干预后,其OD值较CD3+OX40+DMSO组下降,其中浓度为10μg/ml和100μg/ml的GA组尤著,差异有统计学意义(均P<0.05);p38 MAPK抑制剂SB203580干预后,CD4+T细胞的增殖能力减弱,OD值较CD3+OX40+DMSO组下降,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞经anti-CD3 m Ab和anti-OX40 m Ab处理后,CD3+OX40组培养上清液IL-4、IL-5、IL-13的含量较Control组明显增高,差异有统计学意义(均P<0.01);GA和SB203580均可抑制IL-4、IL-5、IL-13的分泌,对于IL-4和IL-13来说,中、高浓度GA和SB203580组较CD3+OX40+DMSO组相比,差异有统计学意义(均P<0.01);对于IL-5来说,仅高浓度GA和SB203580组较CD3+OX40+DMSO组相比,差异有统计学意义(均P<0.05);哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞经anti-CD3 m Ab刺激后,IFN-γ的含量明显增高,CD3组较Control组明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)组;再以anti-OX40 m Ab处理后,CD3+OX40组的IFN-γ水平较CD3+Ig G组降低,差异有统计学意义(P<0.05);中、高浓度GA和SB203580组的IFN-γ水平较CD3+OX40+DMSO组增高,差异有统计学意义(均P<0.01)。(3)CD3、CD3+OX40、CD3+OX40+DMSO、CD3+OX40+100μg/ml GA和CD3+OX40+SB203580等5组之间CD4+T细胞培养72h后的p38 MAPK蛋白的表达无差异,CD4+T细胞经anti-CD3 m Ab和anti-OX40 m Ab联合处理后,p-p38 MAPK蛋白的表达较单纯以anti-CD3 m Ab处理明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);浓度为100μg/ml的GA和SB203580能够显著抑制p-p38 MAPK蛋白的表达,与CD3+OX40+DMSO组相比,差异有统计学意义(组间F值为27.579,P=0.000)。结论:(1)OX40/OX40L共刺激信号分子在CD4+T细胞体外增殖和分泌细胞因子方面具有重要作用;(2)p38 MAPK抑制剂可以阻断OX40/OX40L信号介导的CD4+T细胞的增殖效应和调节分泌细胞因子能力;(3)GA能够抑制anti-OX40 m Ab刺激下的CD4+T细胞的增殖,调节Th1/Th2的产生,下调p38 MAPK的磷酸化水平,说明GA可能直接通过OX40/OX40L/p38 MAPK信号通路抑制CD4+T细胞向Th2方向发展分化。