研究背景:衰老是心血管疾病发生的一个重要的危险因素,衰老过程中伴随着各种血管疾病的发生。衰老引起的血管改变包括动脉粥样硬化斑块的形成及血管反应性的改变,而血管反应性改变的机制很复杂,部分原因与离子通道的改变有关。有研究表明随着年龄增长,BK_Ca表达减弱,NO合成减少,从而影响血管舒缩功能的调节和正常血流动力学的维持,使血管收缩性增加。血管平滑肌主要表达四种类型钾通道,包括电压依赖性钾通道（Kv）,钙激活钾通道(K_Ca),内向整流钾通道（Kir）和ATP敏感性钾通道（KATP）。钾通道对调节兴奋细胞的静息电位,从而维持血管平滑肌张力有重要意义。许多药物的舒血管作用与钾通道有关。我们前期研究证实,牛磺酸对正常大鼠主动脉的舒血管作用与四乙胺敏感钾通道有关,牛磺酸对胰岛素抵抗大鼠的缩血管作用也和钾通道有关。一些扩血管药物如尼可地尔,克罗卡林,吡那地尔和二氮嗪等可直接激活钾通道舒张血管,而一些特异性的钾通道阻断剂如4-氨基吡啶可通过抑制Kv通道的活性收缩血管。在目前已知的血管平滑肌钾通道中,Kv通道是表达最多,种类最丰富的离子通道。由于血管部位及同一部位血管分支的不同,Kv通道的生物学活性也不同。Kv通道在控制静息膜电位和小动脉直径方面起重要作用,因此分析正常情况下血管特异Kv通道的表达及功能非常重要,同样如果Kv通道的表达及功能发生变化将会导致各种疾病。目前研究仅局限于对Kv通道电流的宏观研究,然而不同部位血管平滑肌发挥作用的Kv通道具体亚型的研究还不清楚。利用RT-PCR和Western blot方法已经发现Kv1.2和Kv1.5在大鼠脑动脉,肠系膜动脉,肺动脉均有表达,这些资料表明Kv1通道,特别是Kv1.2和Kv1.5在介导血管舒缩功能方面起重要作用。研究表明,随年龄增加,大鼠主动脉VSM上的K_Ca通道表达增加,膜片钳实验证实K_Ca通道电流相应增加,离体实验证实动脉环对K_Ca通道抑制剂的收缩反应增强;而Kv通道则随年龄增加无明显变化。有研究表明,在老年大鼠,脑动脉和肺动脉K_Ca通道的表达无变化,冠状动脉则表达减少,对K_Ca通道抑制剂的收缩反应减弱。这说明衰老对不同部位BK_Ca通道的影响不一样。血管平滑肌表达多种钾通道,那么衰老对其他钾通道如Kv通道是否有影响目前报道很少。因此找出参与血管衰老的离子通道并阐明其作用机理非常重要。这将有助于我们理解血管衰老的进程,对减缓血管衰老,提高生存质量,降低老年人心血管疾病的发生有重要意义。研究目的:（1）在观察钾通道阻断剂对青年大鼠不同部位小动脉收缩作用的基础上,探讨衰老对钾通道阻断剂在不同部位小动脉的作用的影响。（2）在钾通道阻断剂对青年大鼠和老年大鼠小动脉的作用有差异的基础上,进一步探讨Kv通道功能变化和Kv1.2和Kv1.5基因表达的关系,从而为研究老年人心血管疾病的发生提供实验依据。本实验中钾通道阻断剂选用了四乙胺（Tetraethtylamine,TEA）,格列本脲（Glibenclamide,Gli）,4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）和氯化钡（BaCl₂）。小动脉标本我们选用了肺动脉、冠状动脉、大脑中动脉、肾动脉和肠系膜动脉。研究方法:1.离体微血管环实验方法大鼠脱臼处死后,立即取出肠系膜、肾脏、心脏、肺组织和大脑,浸入4℃的PSS液中。肠系膜及肾动脉环的制备:将取出的肠系膜和肾脏组织浸入含有4℃PSS液的平皿,用大头针固定动脉主干和周围组织,分离去除动脉周围的脂肪组织,选取动脉的三级分支血管,剪取2mm左右的血管环。大脑中动脉环的制备:钝性分离大脑中动脉,在靠近内侧处剪取2mm左右的血管环。冠状动脉血管环的制备:钝性分离冠状动脉,在前降支处剪取2mm的血管环。肺动脉环的制备:用镊子轻轻剥离肺组织,找到与肺内支气管并行的小血管即为肺动脉。沿肺动脉剥离其二级分支血管,剪取2mm左右的血管环。将两根直径为40μm的钢丝穿入管腔,固定血管环在Multi Myograph System-610M浴槽内传感器上。浴槽内含有5ml PSS,持续通以100%O₂,温度控制在37℃,平衡60min后开始实验。平衡期间每隔15min用预热（37℃）的新鲜PSS液更换浴槽内液体一次。血管环的张力变化通过DMT的换能系统采集,并用Chart 5.4生物信号分析处理软件记录在微机上。为了使血管环处于最佳反应状态,分别调整肠系膜动脉、肾动脉、大脑中动脉、冠状动脉、肺动脉的跨壁压,使其分别保持在相当于100 mmHg、80 mmHg、80 mmHg、80 mmHg和80 mmHg的基础压力状态。为了检测血管环在离体状态下对血管活性物质的反应性,在开始正式实验之前,用80 mmol/L的KCl预收缩,当相邻两次刺激的收缩幅度差别不大于10%时,开始正式实验。制作BaCl₂ (10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3和10^-2 mol/L),4-AP (10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3和10^-2 mol/L), Gli (10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3和10^-2 mol/L)和TEA (10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3, 10^-2和3×10^-2 mol/L)的浓度依赖性曲线。以80 mmol/L KCl的收缩幅度为100%,计算药物各浓度的收缩率。2. RT-PCR实验方法青年大鼠或老年大鼠脱臼处死后,立即取出肠系膜、肾脏、心脏、肺组织和大脑,浸入4℃的PSS溶液中。常规方法分离肠系膜动脉、冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉和肺动脉,将分离得到的动脉组织放入液氮中保存。根据UNlQ-10柱式总RNA抽提试剂盒提供的说明书提取总RNA。用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的无菌水溶解RNA,并将RNA放到-70℃保存。用OD值测定RNA的纯度,以OD260/OD280 >1.7认为RNA纯度较好。然后根据TakaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver.3.0提供的方法进行RT-PCR分析,实验用的引物有内参基因GAPDH,目的基因Kv1.2和Kv1.5。首先进行逆转录反应,提取得到的cDNA样品用于PCR反应。PCR反应条件为GAPDH 29个循环, Kv1.2共30个循环,Kv1.5共35个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳（含0.5μg/ml溴化乙锭）,用天能凝胶成像系统观察结果并扫描保存,进行PCR条带灰度扫描,以GAPDH作为内参,作半定量分析。实验结果:1.钾通道阻断剂在青年大鼠与老年大鼠不同部位小动脉的作用（1）4-AP在青年大鼠与老年大鼠五种小动脉的作用4-AP对青年大鼠和老年大鼠大脑中动脉均有收缩作用,4-AP在浓度为10^-3 mol/L时收缩较明显,但当4-AP浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4和3×10^-4时无明显收缩作用。4-AP (10^-3, 3×10^-3 mol/L)对老年大鼠大脑中动脉收缩作用低于青年大鼠,有显著性差异。青年鼠4-AP最大收缩幅度为4.38±0.43 mN,其收缩率为187.54±34.96%。老年鼠4-AP最大收缩幅度为3.87±0.28 mN,其收缩率为172.80±21.23%。EC50值分别为6.18×10^-4 mol/L和5.00×10^-3 mol/L。4-AP对青年大鼠和老年大鼠冠状动脉均有收缩作用,4-AP在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当4-AP浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。4-AP对青年大鼠和老年大鼠冠状动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠4-AP最大收缩幅度为9.29±0.91 mN,其收缩率为151.61±34.10%。老年鼠4-AP最大收缩幅度为8.04±0.91 mN,其收缩率为146.70±19.24%。EC50值分别为2.54×10^-3 mol/L和5.41×10^-3 mol/L。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肾动脉均有收缩作用,4-AP在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当4-AP浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肾动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠4-AP最大收缩幅度为7.61±0.47 mN,其收缩率为167.73±19.02%。老年鼠4-AP最大收缩幅度为6.90±0.91 mN,其收缩率为162.74±22.75%。EC50值分别为1.65×10^-3 mol/L和3.87×10^-3 mol/L。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肺动脉均有收缩作用,4-AP在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当4-AP浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肺动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠4-AP最大收缩幅度为3.49±0.27 mN,其收缩率为67.83±5.39%。老年鼠4-AP最大收缩幅度为3.40±0.21 mN,其收缩率为72.19±7.99%。EC50值分别为1.06×10^-3 mol/L和4.16×10^-3 mol/L。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肠系膜动脉均有收缩作用,4-AP在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当4-AP浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。4-AP对青年大鼠和老年大鼠肠系膜动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠4-AP最大收缩幅度为11.58±1.29 mN,其收缩率为144.34±18.02%。老年鼠4-AP最大收缩幅度为10.89±1.67 mN,其收缩率为133.30±19.02%。EC50值分别为4.16×10^-3 mol/L和4.39×10^-3 mol/L。（2）BaCl₂在青年大鼠与老年大鼠五种小动脉作用BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠大脑中动脉均有收缩作用,在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当BaCl₂浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3时收缩作用不明显。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠大脑中动脉收缩作用无显著差异。青年鼠BaCl₂最大收缩幅度为2.99±0.38 mN,其收缩率为130.92±31.92%。老年鼠BaCl₂最大收缩幅度为3.87±0.16 mN,其收缩率为132.80±21.23%。EC50值分别为2.68×10^-3 mol/L和3.21×10^-3 mol/L。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠冠状动脉均有收缩作用,BaCl₂在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当BaCl₂浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠冠状动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠BaCl₂最大收缩幅度为9.44±1.01 mN,其收缩率为187.90±24.67%。老年鼠BaCl₂最大收缩幅度为9.30±0.47 mN,其收缩率为166.05±29.10%。EC50值分别为2.01×10^-3 mol/L和2.60×10^-3 mol/L。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肾动脉均有收缩作用,BaCl₂在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当BaCl₂浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肾动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠BaCl₂最大收缩幅度为4.95±0.44 mN,其收缩率为130.33±35.67%。老年鼠BaCl₂最大收缩幅度为5.90±0.18 mN,其收缩率为122.74±24.09%。EC50值分别为1.23×10^-3 mol/L和3.18×10^-3 mol/L。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肺动脉均有收缩作用,BaCl₂在浓度为10^-3 mol/L时收缩较明显,但当BaCl₂浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4和3×10^-4 mol/L时无明显收缩作用。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肺动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠BaCl₂最大收缩幅度为4.93±0.42 mN,其收缩率为115.32±9.22%。老年鼠BaCl₂最大收缩幅度为5.24±0.95 mN,其收缩率为106.01±13.77%。EC50值分别为2.79×10^-3 mol/L和9.22×10^-4 mol/L。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肠系膜动脉均有收缩作用,BaCl₂在浓度为3×10^-3 mol/L时收缩较明显,但当BaCl₂浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4和10^-3 mol/L时无明显收缩作用。BaCl₂对青年大鼠和老年大鼠肠系膜动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠BaCl₂最大收缩幅度为8.03±0.85 mN,其收缩率为98.93±4.72%。老年鼠BaCl₂最大收缩幅度为7.89±0.01 mN,其收缩率为113.49±13.58%。EC50值分别为3.45×10^-3 mol/L和4.92×10^-3 mol/L。（3）TEA在青年大鼠与老年大鼠五种小动脉的作用TEA对青年大鼠和老年大鼠大脑中动脉均有收缩作用,TEA在浓度为10^-3 mol/L时收缩较明显,但当TEA浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4和3×10^-4时无明显收缩作用。TEA对青年大鼠和老年大鼠大脑中动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠TEA最大收缩幅度为0.84±0.06 mN,其收缩率为37.11±7.61%。老年鼠TEA最大收缩幅度为0.69±0.09 mN,其收缩率为28.59±3.32%。EC50值分别为2.68×10^-3 mol/L和3.21×10^-3 mol/L。TEA对青年大鼠和老年大鼠冠状动脉均有收缩作用,TEA在浓度为10^-2 mol/L时收缩较明显,但当TEA浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3和3×10^-3 mol/L时无明显收缩作用。TEA (10^-2和3×10^-2 mol/L)对老年大鼠冠状动脉收缩作用低于青年大鼠,有显著性差异。青年鼠TEA最大收缩幅度为7.01±0.82 mN,其收缩率为131.97±67.86%。老年鼠TEA最大收缩幅度为1.35±0.65 mN,其收缩率为26.32±2.93%。EC50值分别为7.67×10^-2 mol/L和1.40×10^-2 mol/L。TEA对青年大鼠和老年大鼠肾动脉均有收缩作用,TEA在浓度为3×10^-2 mol/L时收缩较明显,但当TEA浓度为10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3和10^-2 mol/L时无明显收缩作用。TEA对青年大鼠和老年大鼠肾动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠TEA最大收缩幅度为2.04±0.43 mN,其收缩率为45.24±3.65%。老年鼠TEA最大收缩幅度为2.17±0.20 mN,其收缩率为51.65±8.55%。EC50值分别为1.07×10^-2 mol/L和2.98×10^-2 mol/L。TEA对青年大鼠和老年大鼠肺动脉均有收缩作用,但收缩幅度较低,即使在浓度为3×10^-2 mol/L时, TEA的收缩幅度也不明显。TEA对青年大鼠和老年大鼠肺动脉收缩作用无显著性差异。青年鼠TEA最大收缩幅度为0.15±0.04 mN,其收缩率为2.64±0.49 %。老年鼠TEA最大收缩幅度为0.63±0.06 mN,其收缩率为9.01±2.65 %。EC50值分别为1.09×10^-2 mol/L和1.40×10^-2 mol/L。TEA (10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3, 10^-2和3×10^-2 mol/L)对青年鼠和老年鼠肠系膜动脉均无收缩作用。（4）Gli在青年大鼠与老年大鼠五种小动脉的作用Gli(10^-5, 3×10^-5, 10^-4, 3×10^-4, 10^-3, 3×10^-3和10^-2 mol/L)对青年鼠和老年鼠大脑中动脉,冠状动脉,肾动脉,肺动脉和肠系膜动脉均无作用。2.利用半定量RT-PCR的方法检测青年大鼠与老年大鼠大脑中动脉,冠状动脉,肾动脉,肺动脉和肠系膜动脉Kv1.2和Kv1.5的mRNA的表达。（1）衰老对大鼠血管平滑肌Kv1.2和Kv1.5 mRNA表达的影响。实验结果表明Kv1.2和Kv1.5在青年大鼠和老年大鼠的大脑中动脉,冠状动脉,肾动脉,肺动脉和肠系膜动脉均有表达。①与青年大鼠相比,老年大鼠大脑中动脉Kv1.2的mRNA的表达明显增强（P <0.01）,而且Kv1.5的mRNA的表达也有增强（P <0.05）,有明显的显著性差异。②与青年大鼠相比,老年大鼠冠状动脉、肾动脉和肺动脉Kv1.2的mRNA的表达明显增强（P <0.01）,有明显的显著性差异,但Kv1.5的mRNA的表达无明显变化。③与青年大鼠相比,老年大鼠肠系膜动脉Kv1.2的mRNA的表达无明显变化,但Kv1.5的mRNA的表达减弱（P <0.05）。（2）青年大鼠与老年大鼠Kv1.2和Kv1.5mRNA表达的血管差异性。实验结果表明①青年大鼠Kv1.2 mRNA表达依次为冠状动脉>大脑中动脉>肺动脉>肠系膜动脉>肾动脉。②老年大鼠Kv1.2 mRNA表达依次为大脑中动脉>冠状动脉>肾动脉>肺动脉>肠系膜动脉。③青年大鼠Kv1.5 mRNA表达依次为大脑中动脉>肾动脉>冠状动脉>肠系膜动脉>肺动脉。④老年大鼠Kv1.5 mRNA表达依次为大脑中动脉>肾动脉>冠状动脉>肺动脉>肠系膜动脉。结论:1与青年大鼠相比,老年大鼠大脑中动脉Kv通道阻断剂对其收缩作用和Kv通道mRNA表达均有改变,老年大鼠Kv通道阻断剂对大脑中动脉收缩作用减弱,而Kv1.2和Kv1.5的mRNA表达却增强。2除TEA对老年大鼠冠状动脉收缩作用明显低于青年大鼠之外,TEA对老年大鼠和青年大鼠其余四种小动脉和BaCl₂对五种小动脉的收缩作用均无显著性差异,也就是说衰老对BaCl₂在大鼠五种小动脉上的作用无影响。研究背景:研究表明,原发性高血压、胰岛素抵抗和高血脂之间是相互影响的,此三者被称为X综合征。慢性高果糖喂养可诱导正常大鼠产生胰岛素抵抗,高胰岛素血症和轻度高血压,果糖喂养大鼠可引起高血压确切的机制尚未明确。此外,蔗糖喂养大鼠也会引发高血压,其原因可能是循环中儿茶酚胺升高并通过其缩血管作用升高血压。由于注射生长抑素可抑制果糖喂养诱发的高血压,有人认为,胰岛素抵抗模型中血压升高的程度仅次于高胰岛素血症。已经证明,硫酸氧钒能降低糖尿病大鼠胰岛素水平,抑制果糖诱导的高胰岛素血症及高血压的发生。动物实验发现牛磺酸对果糖引起的高血压有明显的治疗作用,但牛磺酸对胰岛素抵抗引起的高血压大鼠离体血管张力的影响目前尚无报道。牛磺酸（taurine, TAU）是血浆和胞浆含量最丰富的氨基酸之一。除了它与胆汁酸结合的作用之外,牛磺酸已被证实参与了许多重要的生理功能,如维护膜完整性,钙稳态调节,调节蛋白磷酸化,渗透调节和神经传递的调节。牛磺酸对血压正常的动物和高血压大鼠都有舒血管作用。Frandoni等在离体兔耳动脉条实验中发现牛磺酸浓度依赖性地拮抗高钾浴液引起的血管收缩效应。Ristori等在大鼠离体主动脉实验中观察到牛磺酸可降低动脉基础张力,还发现牛磺酸可拮抗去甲肾上腺素和高钾对大鼠离体主动脉的收缩效应,而且这些作用不通过血管的肾上腺素受体,不依赖于细胞外Ca2+。虽然牛磺酸降血糖作用在很多实验动物模型都已得到证实,人体补充牛磺酸治疗胰岛素抵抗的有效性仍然没有得到证实。有资料表明补充牛磺酸抑制了果糖诱导高血糖和高胰岛素血症。我们前期实验证实牛磺酸对正常大鼠主动脉表现为舒血管作用,此作用可能与TEA敏感钾通道有关。但牛磺酸对胰岛素抵抗引起的高血压大鼠离体血管张力的影响目前尚无报道。本实验利用离体实验的方法,研究牛磺酸对胰岛素抵抗引起的高血压大鼠血管张力的影响及其可能的作用机制,为临床胰岛素抵抗患者降压药物的应用提供实验依据。实验目的:观察并比较牛磺酸对正常大鼠和胰岛素抵抗大鼠离体主动脉环的作用,并观察去内皮对牛磺酸对主动脉环作用的影响,利用工具药如L-NAME,吲哚美辛及钾通道阻断剂等探讨其的作用机制。实验方法:高果糖饮食喂养8周建立IR动物模型,测其血压、血糖水平和血胰岛素水平,并计算胰岛素敏感指数。常规制备离体主动脉血管环,将大鼠主动脉血管环悬挂在含有37℃恒温生理盐水营养液的浴管中温浴,通过张力换能器,用Powerlab生物信号记录系统记录血管环张力的变化。观察L-NAME,吲哚美辛及钾通道阻断剂对牛磺酸作用的影响。实验结果:在KCl （ 30 mmol/L）和phenylephrine （1μmol/L）预收缩的情况下,牛磺酸（20–80 mmol/L）对正常大鼠主动脉产生浓度依赖性的舒血管作用,但对IR大鼠主动脉却表现为收缩作用。去内皮和L-NAME预孵均可逆转牛磺酸对IR大鼠的收缩作用,但对正常大鼠主动脉牛磺酸的舒血管作用无影响。四乙胺（Tetraethylammonium, 10 mmol/L）抑制了牛磺酸对正常大鼠的舒血管作用,对IR大鼠主动脉的缩血管作用表现为增强作用。Iberiotoxin （100 nmol/L）也增强了牛磺酸对IR大鼠主动脉的缩血管作用。4 -氨基吡啶（4-aminopyridine, 1 mmol/L）,格列本脲（glibenclamide, 10μmol/L）和吲哚美辛（indomethacin, 10μmol/L）对牛磺酸在正常大鼠主动脉的舒血管作用和IR大鼠主动脉的缩血管作用无影响。结论:牛磺酸对IR大鼠主动脉表现为收缩作用但对正常大鼠主动脉表现为舒张作用;牛磺酸对IR大鼠主动脉的收缩作用是内皮依赖性的,但对正常大鼠主动脉的舒张作用是内皮非依赖性的;四乙胺敏感K+通道可能参与了牛磺酸的这两种舒张和收缩作用;BKCa通道功能障碍和内皮源性因子可能与牛磺酸对IR大鼠主动脉的收缩作用有关。