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研究背景与目的子宫内膜癌是子宫内一种上皮性恶性肿瘤,为女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的健康和生命,且其发病率在世界范围内呈上升趋势。无孕激素拮抗的高雌激素长期作用可增加患子宫内膜癌的风险,但雌激素导致子宫内膜癌的明确机制还不十分清楚。传统理论认为,雌激素通过与雌激素受体(estrogen receptors, ERs)结合后,ERs在细胞核内与目标基因的雌激素反应元件(estrogen-responsive element, ERE)结合,通过基因转录和蛋白合成等过程发挥功能,又称“转录效应”或“核效应”或“基因组效应”。但是,利用该作用模式进行临床治疗并没有使激素依赖性肿瘤如子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等得到有效控制,也不能说明为什么临床上部分ER阳性子宫内膜癌患者对抗雌激素治疗无效,而部分ER阴性患者对抗雌激素治疗有效。通常认为雌激素主要通过核效应发挥作用,但是,研究发现其还能通过快速的反应参与信号转导途径。由于该过程不涉及基因的转录和蛋白合成,被称为“非转录效应”或“非核效应”或“非基因组效应”。有研究表明：雌激素可以迅速激活子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase-AKT, PI3K/AKT)信号通路,在ER阳性的Ishikawa细胞中,PI3K/AKT激活是ERs依赖性的,而在ER低表达的HEC-1A细胞中,是ERs非依赖性的。雌激素的非核效应还可以表现在对Ras/Erk(extracellular-regulated kinase)等其他信号通路的活化。雌激素的非转录效应为子宫内膜癌的有效防治,特别是激素治疗指出了新方向。但是,什么物质介导了雌激素活化PI3K/AKT信号通路还不清楚。G蛋白偶联雌激素受体(G protein coupled estrogen receptor, GPER)是一种膜结合的雌激素结合蛋白,又称G蛋白偶联受体30(G protein coupled receptor30, GPR30),广泛分布在乳腺、卵巢、胎盘、前列腺和子宫等对雌激素有反应的组织中。GPER作为G蛋白偶联受体,与核雌激素受体(nER)无相关性,与雌激素有较高的亲和力。已经发现,GPER在乳腺癌组织中表达,是乳腺癌进展的指标之一。GPER在乳腺癌细胞中TGF-β (transforming growth factor-β,转化生长因子β)参与的丝裂酶原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路中发挥作用。在雌激素核受体表达缺失、GPER阳性表达的SKBR3乳腺癌细胞中发现,雌激素通过GPER能够活化PI3K/AKT通路,促进肿瘤的增殖与发展。但,GPER抑制ERα阳性的乳腺癌MCF-7细胞的增殖。甲状腺癌和卵巢癌细胞中常见GPER高表达。有研究表明,GPER介导的MAPK信号通路参与了子宫内膜癌细胞的增殖和浸润；GPER在非典型增生子宫内膜和子宫内膜癌组织中均高表达,且其表达多见于分化较差、侵肌深和临床分期晚的子宫内膜癌中,并证实GPER表达与AKT的活化呈正相关。但是,GPER与子宫内膜癌细胞中雌激素活化PI3K/AKT信号通路的关系尚不清楚。本文以ER阳性的Ishikawa和ER低表达的HEC-1A两种子宫内膜癌细胞系为研究对象,探讨GPER介导子宫内膜癌细胞雌激素的“非转录效应”。第一部分子宫内膜癌细胞中GPER和的ERs表达1目的检测子宫内膜癌细胞中GPER和ERs的表达情况。2方法2.1检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、AKT、p-AKT、ERα和ERβ的表达和定位Ishikawa和HEC-1A细胞爬片后,采用细胞免疫化学的方法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα和ERβ的表达和定位。Western blot检测Ishikawa和HEC-1A细胞总蛋白中GPER、ERα和ERβ的表达。3结果3.1Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、AKT、p-AKT、ERα和ERβ的表达和定位Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER为细胞膜系统染色,AKT为细胞胞浆和细胞膜染色,p-AKT为细胞胞浆染色,ER a为细胞胞核染色,Ishikawa细胞中ERβ为细胞胞核染色,HEC-1A细胞中ERβ为阴性表达。Western blot结果显示Ishikawa中GPER、ERα和ERβ的表达为阳性,HEC-1A中GPER、AKT、p-AKT和ERα的表达为阳性,ERβ为阴性。4结论验证了子宫内膜癌细胞中目标蛋白的表达情况。第二部分GPER介导雌激素的非转录效应激活PI3K/AKT通路1目的检测雌激素在子宫内膜癌细胞中存在的非转录效应,激活PI3K/AKT通路是否由GPER介导。2方法2.1E2对Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα和ERβ表达的影响Western blot检测不同时间点(0,15,30,60,120min)1μM E2对Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα和ERβ表达的影响。2.2在激活的PI3K/AKT信号通路中GPER与P13K的结合免疫沉淀法检测在E2激活的PI3K/AKT信号通路中GPER与P13K的结合情况。2.3Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER表达下调后PI3K/AKT信号通路的变化脂质体转染GPER shRNA下调Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER的表达,western blot检测PI3K/AKT信号通路的变化。3结果3.1E2对Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER和ER表达的影响Ishikawa和HEC-1A细胞在1×10-6mol/L17β-E2处理0、15、30、60、120min后,western blotting检测实验结果显示Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白的表达水平从处理15min开始即明显升高(P<0.05),其中Ishikawa细胞在30min时达最高,HEC-1A细胞在15min时达最高；而ER α和ER β蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)。3.2在激活的PI3K/AKT信号通路中GPER与P13K的结合免疫沉淀未检测到GPER与P13K结合；3.3Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER表达下调后PI3K/AKT信号通路的变化GPER shRNA稳定转染Ishikawa和HEC-1A细胞中,GPER表达下调,p-AKT表达下调。4结论GPER介导了雌激素的非转录效应激活PI3K/AKT通路。第三部分GPER对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响1目的检测GPER表达下调后,对子宫内膜癌细胞增殖、周期和凋亡的影响以及对裸鼠成瘤能力的影响。2方法2.1MTS法检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER表达下调对细胞增殖的影响；将稳定转染细胞株Ishikawa-shGPER, Ishikawa-Vector, HEC-1A-shGPER和HEC-1A-Vector及原始细胞Ishikawa和HEC-1A接种至96孔板,加入GPER特异抑制剂PTX (pertussis toxin,百日咳毒素)或P13K抑制剂WM (wortmannin)或E2作用后,MTS法检测增殖的影响。2.2流式细胞术检测GPER对Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡和周期的影响；流式细胞术检测Ishikawa-shGPER, Ishikawa-Vector, HEC-1A-shGPER和HEC-1A-Vector及原始细胞Ishikawa和HEC-1A同步培养24h后,凋亡和周期情况。2.3GPER对Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠成瘤能力的影响将Ishikawa, Ishikawa-shGPER, Ishikawa-Vector, HEC-1A, HEC-1A-shGPER和HEC-1A-Vector细胞接种到裸鼠右背部,观察肿瘤生长,研究GPER对Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠成瘤能力的影响；2.4GPER对裸鼠体内Ishikawa和HEC-1A肿瘤中PI3K/AKT信号通路和凋亡的影响免疫组化、TUNEL和western blot检测GPER对裸鼠体内Ishikawa和HEC-1A肿瘤中PI3K/AKT信号通路和凋亡的影响。3结果3.1检测Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER表达下调和抑制剂作用后对细胞增殖的影响Ishikawa和HEC-1A细胞在GPER shRNA稳定转染和PTX或WM作用后,Ishikawa和HEC-1A细胞增殖能力下降(p<0.05)；3.2GPER对Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡和周期的影响GPER下调后,Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡增加(p<0.05),细胞阻滞在G0-G1期(p<0.05),S期细胞减少；3.3GPER对Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠成瘤能力的影响GPER下调后,Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠成瘤能力降低(p<0.05)；3.4GPER对裸鼠体内Ishikawa和HEC-1A肿瘤中PI3K/AKT信号通路和凋亡的影响TUNEL法检测到裸鼠体内肿瘤组织内凋亡细胞增加,免疫组化和western blot发现PI3K/AKT信号通路中p-AKT表达下降,凋亡蛋白caspase-3表达增加和p-Bad表达降低。4结论4.1GPER影响子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡和周期；4.2GPER抑制子宫内膜癌细胞的裸鼠皮下移植瘤的生长是通过PI3K/AKT通路。