论文部分内容阅读
背景:格列齐特属于治疗2型糖尿病的磺酰脲类降糖药物,临床主要用于治疗非胰岛素依赖糖尿病。已有大量研究证实磺酰脲类药物临床应用降血糖作用时存在较大个体差异性,其中基于代谢酶与转运体的基因多态性是其重要机制之一。本课题旨在研究格列齐特与代谢酶CYP2C9及转运体OATP1B1的基因多态性之间的内在关联机制,为磺酰脲类药物临床合理用药从而实现个体化用药提供理论基础和实验依据。目的:通过建立稳定高表达野生型和突变型CYP2C9重组酶模型以及OATP1B1重组质粒模型,系统研究CYP2C9*1、*2和*3对格列齐特代谢的影响,以及OATP1B1*5、*1a、*15-HEK293T对格列齐特转运的影响,深入探讨CYP2C9和OATP1B1的遗传多态性影响格列齐特临床疗效个体差异的分子学机制。方法:（1）建立可靠、稳定的格列齐特在CYP2C9重组酶中的孵育体系,并建立在该体系中格列齐特的LC-MS定量检测方法,检测孵育体系中剩余格列齐特的浓度。（2）系统研究野生型CYP2C9*1、突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3重组酶孵育体系中,格列齐特浓度与孵育时间、酶浓度间的相关性。并通过测定重组酶体系中格列齐特浓度,比较系列格列齐特浓度在CYP2C9野生型与突变体之间的代谢情况,拟合酶动力学曲线,计算并比较野生型和突变型孵育体系中酶动力学参数Vmax、Km、Clint。（3）培养HEK293T细胞,建立该细胞中格列齐特的LC-MS检测方法,细胞样品经乙酸乙酯萃取后检测细胞破碎液中的格列齐特。（4）用MTT法检测格列齐特对HEK293T的细胞毒性,在此基础上研究OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*1a-HEK293T及OATP1B1*15-HEK293T细胞中摄取时间、底物浓度对格列齐特摄取过程的影响。通过测定细胞破碎液中格列齐特浓度,比较3种不同基因型质粒模型中格列齐特的摄取动力学参数Vmax、Km、Clint。（5）统计分析采用SPSS 12.0软件进行数据处理,所有数据均以平均数±标准差（Mean±SD）表示,P<0.05为具有显著性差异,P<0.01为具有极显著性差异。结果:（1）本实验建立的测定代谢酶孵育体系及HEK293T细胞样品中格列齐特的LC-MS分析方法专属性强、精密度高、稳定性好,符合生物样本分析的相关要求。（2）格列齐特在不同蛋白浓度（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/ml）野生型CYP2C9*1、突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3重组酶孵育体系中孵育100 min后,结果显示格列齐特在0.2 mg/ml的CYP2C9*1,0.2 mg/ml的CYP2C9*2,0.4mg/ml的CYP2C9*3孵育体系中格列齐特的代谢率达到80%以上。（3）格列齐特在0.2 mg/ml野生型CYP2C9*1、突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3重组酶孵育体系中分别孵育0,10,20,40,80,100,120 min后终止反应,结果显示在不同孵育体系中的最佳孵育时间分别为60 min,80 min,100min。（4）格列齐特（1、2.5、5、10、20、40、80μM）在野生型CYP2C9*1重组酶孵育体系中酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为4.97±0.56μM、197.31±3.11 pmol/min/pmol、39.69±2.51μL/min/（mg proteins）;在突变型CYP2C9*2酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为5.18±0.21μM、135.35±1.06pmol/min/pmol、26.12±1.89μL/min/（mg proteins）,在突变型CYP2C9*3酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为6.57±1.82μM、102.21±4.94 pmol/min/pmol、15.55±1.71μL/min/（mg proteins）。与野生型CYP2C9*1相比,突变型CYP2C9*2、CYP2C9*3酶反应体系中的格列齐特Km值有所增大,但Vmax及Clint显著减小（P<0.05或P<0.01）,提示格列齐特在突变型CYP2C9*2、CYP2C9*3酶反应体系中代谢活性比野生型CYP2C9*1明显降低。（5）OATP1B1*1a-HEK293T、OATP1B1*5-HEK293T及OATP1B1*15-HEK293T细胞生长状态良好,形态大小均一。通过MTT检测法确定格列齐特在1-80μM浓度范围内对HEK293T细胞毒性影响较小。（6）格列齐特在OATP1B1*5-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为14.69±1.68μM、5.84±0.37 pmol·min-1·mg-1protein、0.39±0.27μL/min/（mg proteins）。在OATP1B1*15-HEK293T细胞的摄取动力学参数Km、Vmax及CLint分别为9.80±0.35μM、11.02±0.39 pmol·min-1·mg-1protein、1.12±1.89μL/min/（mg proteins）;而在OATP1B1*1a-HEK293T细胞摄取的动力学参数Km、Vmax及CLint分别为8.19±0.86μM、12.97±0.79 pmol·min-1·mg-1 protein、1.58±0.25μL/min/（mg proteins）。与野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比,突变型OATP1B1*15-HEK293T细胞中格列齐特摄取的Km及Vmax值无明显变化,但CLint明显降低（P<0.05）;突变型OATP1B1*5-HEK293T细胞中格列齐特摄取的Km值明显增大（P<0.05）,但Vmax、CLint值显著减少（P<0.01）。提示格列齐特在突变型OATP1B1*15-HEK293T、OATP1B1*5-HEK293T细胞中的摄取能力比野生型OATP1B1*1a-HEK293T明显减弱,在OATP1B1*5-HEK293T细胞中的摄取能力相对更弱。结论:（1）格列齐特可被野生型CYP2C9*1、突变型CYP2C9*2、突变型CYP2C9*3重组酶代谢,与野生型CYP2C9*1相比,突变型CYP2C9*2、突变型CYP2C9*3重组酶的代谢活性显著降低。（2）格列齐特可被OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T、OATP1B1*1a-HEK293T细胞摄取转运。与野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比,格列齐特在突变型OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T细胞中的转运能力明显减弱,其中OATP1B1*5-HEK293T细胞的转运能力相对更弱。