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大豆（Glycine max L.Merrill）是世界上最重要的油料及经济作物之一,含有丰富的营养成分,在食品、饲料等方面都具有广泛用途。我国大豆产量较低,致使大豆对外依存度高,威胁国家粮油安全。在有限耕地的国情下,提高大豆单产是大豆育种的重要目标之一。开花期是影响大豆产量及种植适应性的重要农艺性状,因此,挖掘开花期调控基因,对于提高大豆产量及解析大豆种植适应性机制具有重要意义。生物钟参与许多植物中的生理活动。其中,LNK（Night light-inducible and clock-regulated）家族是生物钟的重要基因在开花期及调控生物钟等方面具有重要的作用,但大豆中LNK家族基因的功能尚未见报道。本研究通过同源比对分析后发现,大豆中共含有12个LNK家族基因,其中包括4个GmLNK1和4个GmLNK2基因,通过生物信息学分析、CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9）、遗传转化、q RT-PCR及烟草瞬时转化等技术,分别对GmLNK1和GmLNK2家族基因调控大豆开花的分子机制进行深入解析。此外,在1295份大豆品种中,分别对GmLNK2家族基因等位变异进行筛选,为进一步解析基因进化机制奠定基础。研究结果完善了光周期调控大豆开花的分子机理及网络,同时为培育早熟高产的大豆品系育种提供分子标记,应用前景广阔。1.在Phytozome数据库中,下载与拟南芥AtLNK1/2同源的大豆基因,发现大豆中有4个GmLNK1和4个GmLNK2基因,按照染色体顺序进行排序,分别命名为GmLNK1a、GmLNK1b、GmLNK1c和GmLNK1d以及GmLNK2a、GmLNK2b、GmLNK2c和GmLNK2d。序列同源比对分析结果表明,GmLNK1的氨基酸序列与AtLNK1的保守率为25.42%-26.32%,GmLNK2的氨基酸序列与AtLNK2的保守率为34.04%-36.27%;2.根据GmLNK1a/1b/1c/1d和GmLNK2a/2b/2c/2d的外显子序列,分别设计4个靶点,并将其组合到基因敲除载体pYLCRISPR/Cas9-DB上。为了保证稳定转基因效率,首先利用转基因大豆根毛转化方法,检验各个靶点效率,结果表明,GmLNK1的4个靶点中,靶点1（LNK1T1）和靶点2（LNK1T2）能够同时敲除GmLNK1a和GmLNK1b,靶点4（LNK1T4）能够同时敲除GmLNK1c和GmLNK1d,靶点3（LNK1T3）无效。在GmLNK2的4个靶点中,靶点1（LNK2T1）和靶点2（LNK2T2）能够同时敲除GmLNK2a和GmLNK2b,并均具有较高的敲除效率,靶点4（LNK2T4）能够同时敲除GmLNK2c和GmLNK2d,靶点3（LNK2T3）无效;3.通过利用稳定遗传转化技术,以大豆品种Williams 82（W82）为受体,分别获得杂合T0代GmLNK1和GmLNK2四突变体转基因材料,并繁殖到T1代,通过PCR及测序技术对T1代植株进行检测和筛选后,得到2株GmLNK2纯合四突变体（quadruplemutant of GmLNK2,Gmlnk2-4m）,及2株GmLNK1杂合四突变体（heterozygotequadruple mutant of GmLNK1,h Gmlnk1-4m）;4.分别于长、短日照条件下,观察Gmlnk2-4m和h Gmlnk1-4m的开花期表型,发现长日照条件下,Gmlnk2-4m的开花期相比于W82显著提前,而h Gmlnk1-4m的开花期并没有显著变化。短日照条件下,Gmlnk2-4m与h Gmlnk1-4m的开花期均无显著变化。说明在长日照条件下,GmLNK2抑制开花,而GmLNK1的功能仍需进一步研究;5.GmLNK通过促进大豆E1基因的表达,调控大豆开花期。为进一步明确4个GmLNK2同源基因的功能是否存在差异,结合烟草瞬时转化试验,检测4个GmLNK2基因对E1的表达调控作用。结果表明,GmLNK2c对E1有激活作用,且其余3个GmLNK2的同源基因与GmLNK2c相互依赖进一步激活E1;6.在1295份自然群体中,分别鉴定了4个GmLNK2基因的不同等位变异,为进一步培育早熟高产大豆品种提供分子基础。