一、研究背景强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种遗传相关性显著的自身免疫疾病,早期以炎症表现为主,发展到晚期,累及脊柱关节、骶髂关节、髋关节等,发生脊柱畸形、髋关节融合、骨性强直等,形成典型的脊柱“竹节样改变”,严重影响患者的生活能力和运动功能,致畸致残率高。研究表明,AS的病理性炎症和细菌感染,巨噬细胞激活,部分细胞因子,HLA-B27蛋白错误折叠,自噬等有关,但是受限于病变组织不易获取、骨化进程缓慢、个体差异大等多种原因,人们对于AS的病理性新骨形成了解的依然非常有限,抑制慢性的异常成骨面临严峻的挑战。因此,通过对AS异常成骨机制的探索和研究,研发靶向治疗药物,对发病机制采取有针对性的干预措施,抑制病理性骨化,从而避免病人的脊柱及关节强直及藉此带来的畸形,彻底改善病人的运动功能和生活质量,具有重要的临床意义。人类基因组中的非编码RNA(nc RNA)占所有遗传物质的98%,起初被认为不具备生物学功能。随着研究的深入,多种nc RNA被发现可以调节基因的表达,广泛参与人体生理病理活动,其中长链非编码RNA(lnc RNA)和微小RNA(mi RNA)越来越受到研究重视。mi RNA能够通过与靶基因的3’非编码区(3’UTR)结合,在转录后水平抑制翻译或直接降解m RNA,从而影响多种靶基因的表达,包括细胞成骨分化的基因。而lnc RNA能够参与调控表观遗传、细胞周期和细胞分化等生理过程,同样可以调控细胞成骨分化。并且,lnc RNA与信使RNA(m RNA)可以通过一种竞争性内源RNA(ce RNA)的交流方式,以mi RNA为中介调控基因的表达。目前为止,lnc RNA如何调控AS病理性成骨的机制还没有相关报道。因此,我们猜想AS病理性骨化中的lnc RNA是否有可能通过ce RNA机制调控了mi RNA/m RNA的表达而导致发病过程。本课题主要研究和探索了lnc-NR＿045553/mi R-17-5p/FGD5这个调控轴在调节骨髓MSC成骨分化中的作用和分子机制。二、研究目的第一部分:从全基因表达谱的角度对AS髋关节周围韧带样本的基因表达情况进行全方位的解读,探索AS中的差异表达基因并进行分析,以及后续在韧带组织标本中验证这些差异表达的基因,寻找AS发病的相关分子机制。第二部分:通过设计体外细胞实验来筛选影响AS骨髓MSC成骨的ce RNA并研究和探索lnc-NR＿045553/mi R-17-5p/FGD5这个调控轴在调节骨髓MSC成骨分化中的作用和机制。第三部分:以转录组测序的方法为切入点,寻找FGD5下游的信号通路,探索其影响骨髓MSC成骨分化的具体机制。第四部分:研究mi R-17-5p在动物模型中对AS病理性骨化的影响。三、研究方法第一部分:(1)在全髋关节置换手术过程中取得髋关节周围韧带并剪碎,于液氮中保存;(2)粉碎髋关节周围韧带,试剂盒提取RNA,质控后进行基因芯片检测获得数据;(3)深入挖掘分析芯片数据,利用数据库进行mi RNA靶基因预测及网络构建,GO和KEGG信号通路富集分析寻找与AS发病相关的通路,构建mi RNA-GO网络;信号传导网络及lnc RNA-m RNA共表达网络构建,根据lnc RNA、mi RNA、m RNA表达相关性和可结合性,构建AS的ce RNA网络;(4)实时定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)对部分差异表达基因进行验证。第二部分:(1)利用骨髓MSC贴壁生长的特性,先用Ficoll淋巴细胞分离液提取全髋关节置换手术中从骨髓腔获得的骨髓MSC,然后培养扩增,借助形态学观察和流式仪检测细胞表面Marker对细胞进行纯度的鉴定;(2)诱导AS和正常骨髓MSC,用茜素红染色和钙结节定量的方法比较各组的成骨分化功能;(3)在AS和正常骨髓MSC中对芯片建立的lnc-NR＿045553/mi R-17-5p/FGD5轴中的分子进行PCR验证,比较相关性;(4)用PCR和免疫印迹(Western Blot)验证si FGD5的干扰效率并合成sh RNA,包装sh RNA和过表达FGD5的慢病毒,进一步验证效率;(5)FGD5在AS骨髓MSC中进行过表达和敲低的功能实验,PCR检测ALP、Runx2、COL1A1等基因表达改变,ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量观察细胞成骨变化;(6)mi R-17-5p在AS骨髓MSC中进行过表达和敲低的功能实验及回复实验,PCR和Western Blot检测FGD5表达变化,ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量观察细胞成骨变化,荧光素酶报告基因实验验证mi R-17-5p与FGD5的m RNA可结合性;(7)lnc-NR＿045553在AS骨髓MSC中通过荧光原位杂交(FISH)确定细胞中的位置,然后进行过表达和敲低的功能实验及回复实验,PCR检测lnc-NR＿045553、mi R-17-5p、FGD5的表达变化,Western Blot检测FGD5蛋白水平,ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量观察细胞成骨变化,荧光素酶报告基因实验验证mi R-17-5p能否与lnc-NR＿045553结合。第三部分:(1)实验分为对照组,诱导组,FGD5稳定敲低诱导组,在成骨诱导分化3天后,收细胞RNA转录组测序;(2)分析比较诱导组和FGD5稳定敲低诱导组之间差异基因的GO富集和信号通路富集,寻找与成骨分化相关的信号通路;(3)骨髓MSC中Western Blot对分析得到的经典Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin进行验证,同时加入特异性信号通路抑制剂Wnt-C59实施回复实验,分为sh-NC组,FGD5敲低组,LV-NC组,FGD5过表达组,LV-NC+C59组,FGD5过表达+C59组;(4)PCR检测ALP、Runx2、COL1A1等基因表达改变;(5)ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量观察细胞成骨变化。第四部分:(1)获得全膝关节置换手术患者的关节软骨,提取蛋白聚糖;(2)蛋白聚糖诱导强直性脊柱炎小鼠模型(PGISp),并利用X线和组织学染色鉴定;(3)利用mi R-17-5p过表达处理AS小鼠模型,组织学染色检测干预效果。四、研究结果第一部分:(1)AS和对照组的髋关节周围韧带之间存在661种lnc RNA,574种m RNA,22种mi RNA表达有差异;(2)GO分析表明,差异表达的m RNA以及mi RNA的靶基因主要涉及炎症、细胞激活过程、血管生成、骨化等与AS发病机制显著相关的生物学过程;信号通路分析提示与AS相关的通路有细胞因子-细胞因子受体、泛素调控的蛋白质分解、JAK-STAT信号通路、TGF-β信号通路、BMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路以及HIF-1信号通路等;(3)信号网络分析结果表明ATM和ITGA2这两个基因差异度最高;(4)建立的ce RNA网络中包含6种lnc RNA,8种m RNA和6种mi RNA。第二部分:(1)形态学和细胞表面Marker成功鉴定了提取的骨髓MSC;(2)AS的骨髓MSC成骨能力高于正常对照组;(3)骨髓MSC中PCR结果初步证明存在lnc-NR＿045553/mi R-17-5p/FGD5这个ce RNA调控轴;(4)成功筛选得到干扰效果最好的si FGD5,合成的sh FGD5和过表达效率有保证;(5)FGD5过表达或敲低后,ALP、Runx2、COL1A1等基因表达的PCR结果、ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量与FGD5变化一致,说明FGD5可以促进AS骨髓MSC成骨分化;(6)mi R-17-5p过表达或敲低后,FGD5表达与mi R-17-5p相反,成骨基因表达、ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量与mi R-17-5p变化相反;荧光素酶报告基因实验证实mi R-17-5p可以与FGD5的m RNA结合;(7)lnc-NR＿045553经FISH实验检测为存在于细胞质中,过表达或敲低后,mi R-17-5p表达与lnc-NR＿045553相反,FGD5表达与lnc-NR＿045553一致,成骨基因表达、ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量与lnc-NR＿045553一致;mi R-17-5p经荧光素酶报告基因实验证明可以与lnc-NR＿045553结合。第三部分:(1)转录组测序后,GO和信号通路富集分析发现与成骨有关的Wnt信号通路可能参与了FGD5的成骨分化调控;(2)Western Blot结果显示Wnt信号通路关键蛋白β-catenin与FGD5表达变化一致,并且能够被特异性通路抑制剂Wnt-C59抵抗,成骨基因表达、ALP染色和活性定量、茜素红染色和钙结节定量证明了FGD5影响成骨分化的的下游信号通路Wnt/β-catenin。第四部分:(1)X线和组织学染色结果表明,蛋白聚糖诱导的AS小鼠模型能够较好地模拟晚期脊柱“竹节样改变”和椎间盘融合、破坏;(2)mi R-17-5p过表达干预,对AS小鼠模型椎间盘的破坏和病理性骨性增生有一定的缓解作用。五、结论本课题通过四个部分的实验,证明了lnc-NR＿045553能够通过mi R-17-5p/FGD5调节骨髓MSC成骨分化,探索了AS病理性新骨形成的致病机理。FGD5主要通过经典Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓MSC成骨分化;mi R-17-5p与FGD5的m RNA结合和负调控可以抑制骨髓MSC成骨分化;lnc-NR＿045553定位于细胞质,以ce RNA的方式与FGD5竞争性地结合mi R-17-5p,缓解mi RNA对靶基因的负调控作用,促进FGD5的表达,从而正向调控成骨分化过程。另外,动物模型中还发现mi R-17-5p具有减轻脊柱病理性骨化的作用。这些结果为深入理解AS病理性新骨形成的发病机制以及研发针对新骨形成的治疗靶点提供了理论依据。