氧化性DNA损伤是脑缺血再灌早期发生的一个显著现象,是引起神经元细胞死亡的重要因素。在没有迅速修复的情况下,DNA损伤堆积于细胞内,并通过激活不同的信号途径,引起细胞死亡。脑缺血再灌引起的细胞内氧化性DNA损伤主要通过碱基切除修复(Base Excision Repair,简称BER)途径修复,BER的功能完整性是神经元存活的基本条件。本实验室以前的研究发现脑缺血预适应过程中BER系统具有可逆性调控机制。有报道发现,在某些其它类型细胞中外源性添加NAD~+可以抵抗DNA损伤引起的细胞死亡。因此,在氧糖剥夺模(OGD)神经元损伤离体模型中,外源性添加NAD~+可能减少缺血性的神经元损伤,其作用过程是否涉及对DNA损伤修复系统的调节还不清楚。因此,本文在神经元原代培养的OGD模型上,从NAD~+的保护作用入手,深入探讨了NAD~+对OGD引起的神经元DNA损伤的影响,以及与之密切相关的BER酶类活性和表达水平的变化,进一步确定了缺血再灌损伤引起的BER酶类活性变化的内部机制,以及NAD~+对酶活性的间接影响。实验结果如下:1.神经元体外原代培养物的氧糖剥夺模型:NAD~+对氧糖剥夺神经元的保护存在着浓度依赖性,随着NAD~+浓度增加,保护能力逐渐增强。15mM的NAD~+使2小时氧糖剥夺(OGD)后神经元存活率从24.0±2.2%升高到85.1±2.3%。NAD~+的加入时间对于神经元的保护有显著性影响,OGD前使用NAD~+的保护效果最佳,OGD结束后1小时内使用仍有部分保护作用,OGD后2小时使用NAD~+不再显示保护性作用。2.为了探讨NAD~+对神经元保护作用的内在机制,观察了NAD~+对神经元OGD模型的DNA损伤的影响。对神经元DNA损伤的测定表明,NAD~+大幅降低了OGD引起的DNA链AP位点增多和DNA单链断裂。经PANT法和PARS免疫细胞化学染色,外源性添加NAD~+与添加PARP的抑制剂3-AB的对比显示,NAD~+可以同时阻止DNA的损伤和PARP的激活,而3-AB则只能抑制PARP的激活。该结果提示,NAD~+对神经元氧糖剥夺损伤的保护作用并非只通过抑制PARP-1的激活实现的,而是主要集中在对神经元DNA损伤的保护性方面。3.为了进一步探讨NAD~+添加是否通过加强碱基切除切除修复途径减少了氧糖剥夺引起的神经元DNA损伤,测定了碱基切除修复酶类活性变化。本研究发现,原代培养神经元的OGD损伤模型中,碱基切除修复系统中几个关键酶APE和β-pol的活性以及碱基切除修复系统的总体活性均在OGD损伤早期就被抑制,且在随后的实验期间没有得到恢复。而NAD~+干预条件下,APE和β-pol的活性以及碱基切除修复系统的总体活性得到恢复。结果提示NAD~+通过提高内源性DNA修复能力,有效地抵抗了OGD引起的神经元DNA损伤。4.为了确定碱基切除修复酶类总体活性变化的具体原因,观察了OGD模型及外源性添加NAD~+对OGD模型干预条件下,酶蛋白表达水平的变化以及酶蛋白磷酸化修饰的情况。Western印迹检测表明,核蛋白提取物中几种主要的BER修复酶的表达水平在OGD后0-6小时内没有显著性变化。免疫共沉淀结果显示,OGD通过影响APE和β-pol的磷酸化水平调控了细胞的碱基切除修复系统的活性,造成了神经元DNA损伤的扩大和进一步的细胞整体损伤。NAD~+主要通过抑制碱基切除修复酶类的磷酸化,阻止了OGD引起的磷酸化失活现象。结论再灌早期BER功能失调是一个可逆的过程,外源性补充NAD~+可以逆转BER活性的丧失,其逆转的机理在于抑制修复酶的磷酸化修饰作用。我们的结果提示NAD~+可能作为治疗临床缺血性脑损伤疾病的良好药物,同时碱基切除修复酶类在缺血性脑损伤中的高度可逆性调控及其对损伤结果的重要影响也为以后设计治疗缺血性脑损伤的药物提供了新的治疗靶点。