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背景:急性心肌梗死(AMI)往往伴随强烈的免疫炎症反应,是损伤部位修复机制的重要调控因素之一;但免疫炎症反应过度的激活将导致心肌细胞的进一步损伤,推动心室重塑的发生和发展,免疫炎症反应在心肌梗死病理生理进程中起着双重的调节作用。近来研究表明,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有对免疫炎症反应的调节作用,移植到梗死心肌后可以调节受体的免疫炎症反应,进而延缓心肌梗死后心室重塑的进展。目的:研究BMSCs移植对心肌梗死后心功能不全家兔核因子-κB(NF-κB)及炎性因子(IL-6、TNF-α、CRP)的影响;以及探讨BMSCs移植后减轻炎症反应,从而改善心肌重塑的可能机理;及评价BMSCs移植治疗心梗后心功能不全的有效性,为临床防治AMI后患者心肌重塑和治疗心功能不全提供安全、有效的方法。方法:本研究以新西兰白兔为研究对象,随机分为:对照组(假手术组)、AMI后心功能不全模型组(开胸结扎冠脉LAD)、BMSCs组(开胸结扎冠脉LAD+BMSCs移植)。1开胸结扎冠状动脉前降支(LAD)中段建立兔AMI后心功能不全动物模型。2采用密度梯度离心法分离BMSCs,经贴壁法分离和培养BMSCs,经5-氮胞苷诱导后利用DAPI进行细胞标记。3透射电镜观察经5-氮胞苷诱导28天后的BMSCs向心肌细胞的分化。4在急性心肌梗死后14天时,开胸移植自体BMSCs。5心功能的评价:分别于心梗手术前、心梗手术后7天和干细胞移植后28天时进行心脏超声检查,观察心功能的情况。6血清炎性因子测定:分别于术前、术后7天、细胞移植后28天经耳缘静脉抽血,采用ELISA法检测血清IL-6、TNF-α、CRP及MMP-9的浓度,观察炎性因子的变化情况。7采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,于干细胞移植后28天检测心肌组织NF-кB、IL-6、TNF-α及MMP-9的mRNA表达。结果:1 BMSCs的体外分离和培养:抽取的骨髓经分离液离心后,可看到分离液和血浆之间的BM-MNC层。通过在培养瓶中贴壁和换液纯化获得BMSCs,培养72h后可见散落的BMSCs贴壁生长,4～7天后BMSCs快速增殖,集落群逐渐增大,11～14天细胞集落间出现大片融合,最后铺满大部分瓶底。大部分BMSCs呈长梭形,胞核较大。当集落达80%～90%融合时进行消化传代,传代培养3～5天开始汇合,继续传代扩增。第10代以后的BMSCs增长速度明显减慢。2急性心肌梗死后心功能不全家兔模型的建立:34只新西兰白兔完成了手术,处死前有24只成活。其中对照组8只全部存活;AMI后心功能不全模型组存活8只,死亡4只;BMSCs组存活8只,死亡6只。术前各组的左室舒张末内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(LVFS)均无统计学差异。AMI后心功能不全模型制作后7天,BMSCs组、AMI后心功能不全模型组的EF值比正常对照组降低(52.6±4.0、51.6±4.5、68.3±1.4,F=54.235,P<0.001)差别有统计学意义。AMI后心功能不全模型组、BMSCs组的组间EF值差异无统计学意义。3自体BMSCs移植对急性心肌梗死后心功能的影响:细胞移植后28天,正常对照组、BMSCs组EDD均明显低于AMI后心功能不全模型组(13.9±1.0、14.7±1.4、16.7±1.1,F=11.97,P<0.001),EF及FS均明显高于AMI后心功能不全模型组(EF:70.5±3.6、67.0±5.8、57.1±5.5,F=15.05,P<0.001;FS:34.5±3.1、31.0±5.9、25.5±4.4,F=7.02,P=0.005),差异具有统计学意义。4血清炎性因子检测结果:正常对照组、BMSCs组和AMI后心功能不全模型组的血清IL-6、TNF-α、CRP及MMP-9浓度在手术前无统计学差异。手术后7天,与正常对照组相比BMSCs组、AMI后心功能不全模型组的血清IL-6、TNF-α、CRP及MMP-9的浓度均显著增加(IL-6: 255.6±22.9、373.4±123.7、377.3±125.1,F=3.64, P=0.04;TNF-α: 161.5±17.3、227.8±62.8、227.9±63.6,F=4.25,P=0.02;CRP:6.33±0.34、10.18±3.71、10.18±3.72,F=4.28, P=0.02; MMP-9: 62.6±11.2、90.8±26.8、89.7±28.8 F=3.65, P=0.04),差异有统计学意义;BMSCs组和AMI后心功能不全模型组差异无统计学意义。细胞移植后28天,正常对照组、BMSCs组的血清IL-6、TNF-α、CRP及MMP-9的浓度比AMI后心功能不全模型组显著降低(IL-6: 245.6±20.4、227.5±21.3、304.9±27.5,F=24.19, P <0.01; TNF-α: 160.3±16.0、145.2±12.5、197.5±13.7,F=28.91, P<0.01;CRP: 5.87±0.49、6.41±0.78、7.81±0.69,F=17.93, P<0.01;MMP-9: 63.0±9.5、58.9±4.2、80.7±7.4,F= 19.91, P<0.01),差异有统计学意义。5心肌组织NF-кB、IL-6、TNF-α及MMP-9的mRNA表达变化:正常组、BMSCs组NF-кB、TNF-α、IL-6及MMP-9的mRNA表达比AMI后心功能不全模型组显著降低(NF-кB:0.09±0.06、0.59±0.47、1.33±0.52, F=18.64,P<0.001;TNF-α: 1.00±0.43、1.87±0.78、3.70±1.64, F=13.06, P<0.001; IL-6: 1.12±0.66、3.81±1.94、6.03±1.85, F=18.86, P<0.001; MMP-9:1.64±0.67、2.47±1.78、5.53±2.33, F=11.04, P=0.001),差异具有统计学意义。6心功能与炎性因子的相关性:细胞移植后28天时,EF与血清炎性因子呈负相关(CRP: r=-0.605, P=0.002, Y= 93.959-4.344 X;TNF-α: r=-0.425, P=0.039, Y= 85.346 -0.122X;IL-6: r=-0.475, P=0.025, Y=86.967 -0.085X;MMP-9: r=-0.501, P=0.013, Y= 86.199 -0.316X);与心肌组织炎性因子呈负相关(TNF-α: r=-0.592, P=0.002, Y=71.206-2.887X;IL-6: r=-0.512, P=0.011, Y=70.392-1.509X;MMP-9: r=-0.822, P<0.001, Y= 86.199 -0.316X);与心肌组织NF-кB呈负相关(r=-0.866, P=0.001, Y=71.621-10.039X)。其中Y代表LVEF值,X代表各个炎性因子。结论:1自体BMSCs移植可显著降低心肌梗死后炎症反应及NF-кB表达。2自体BMSCs移植可通过减轻心梗后免疫炎症反应抑制心室重塑的进展,从而达到改善心功能的作用。3采用密度梯度离心法及贴壁法获得BMSCs,采用5-氮胞苷诱导,经DAPI标记,成功地获得标记的干细胞。