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肌腱病是常见的运动损伤性疾病之一，严重影响着热爱运动人群的生活质量，特别是运动员的运动生涯。在人的正常生理情况下，运动过程中肌腱的微损伤与肌腱修复保持着一定的平衡。当这种平衡被打破，肌腱微损伤加重，将产生病理变化，最终发展成为肌腱病。在我们前期的临床工作中发现，肌腱病患者的肌腱组织中存在着异位骨化，异位骨化是肌腱病的主要病理表现之一，其产生原因可能为肌腱过度使用引起的肌腱微小损伤所致，但肌腱中骨化的组织来源还不是十分清楚。我们课题组进一步研究发现，体外TSCs在一定的牵伸的条件下，可向成骨方向分化；提示肌腱微损伤与修复过程中，机械牵伸可能导致TSCs向成骨方向分化，加重肌腱微损伤，致使肌腱自身修复失败。因此，TSCs成骨分化控制是肌腱病发病机制研究的关键科学问题之一，研究TSCs成骨分化调控对肌腱微损伤修复的作用及机制具有重要的科学意义和临床价值。在对间充质干细胞（MSCs）相关研究中发现，RhoA是Rho家族的重要一员，具有机械敏感性，机械牵伸可使其激活而发生生物学效应，参与了干细胞成骨过程。ROCK是RhoA家族主要的下游受体，近年研究发现RhoA/ROCK信号分子影响干细胞的分化命运。同理推测，在调控TSCs的成骨分化方面，RhoA/ROCK信号分子可能发挥了重要作用。机械牵伸是否是通过RhoA/ROCK信号分子的表达来调节TSCs成骨分化，目前还需要进一步探讨。基于前人的报道和我们既往的工作基础上，我们提出以下假说：机械牵伸载荷引起TSCs中RhoA/ROCK信号分子表达变化，从而促进TSCs向成骨方向分化，抑制TSCs的RhoA/ROCK信号分子的表达，机械牵伸TSCs后成骨分化减弱。根据以上假设，我们将课题研究分三部分。1.不同机械牵伸条件对TSCs成骨分化的影响1.1分别从基因表达和蛋白表达两个方面着手，研究TSCs在不同牵伸条件下，成骨分化指标BMP2和Runx2的表达水平及变化趋势。1.2实验结果1.2.1不同牵伸强度对BMP2、Runx2基因表达影响BMP2在牵伸1天时4%、8%牵伸强度下mRNA表达无显著变化，在牵伸2天和3天时，4%牵伸强度下mRNA表达无显著变化，8%牵伸强度下BMP2mRNA表达变化上升，具有统计学意义（P＜0.05）。Runx2在不同时间点（1天、2天、3天），4%和8%牵伸强度下mRNA表达与对照组相比有显著差异（P＜0.05），并且随牵伸强度的增加而增加。1.2.2不同牵伸强度对BMP2、Runx2蛋白表达影响BMP2在不同时间点4%强度下对照组相比无显著差异（P＞0.05），在牵伸1天、2天时，8%牵伸强度下BMP2表达与对照组相比无显著提高（P＞0.05），牵伸3天时与对照组相比显著提高。（P＜0.05）。Runx2在牵伸1天、2天、3天时，4%强度下与对照组相比无显著提高（P＞0.05）；在牵伸1天时，8%牵伸强度下Runx2表达与对照组相比无显著提高（P＞0.05），牵伸2天、3天时与对照组相比显著提高。（P＜0.05）。1.2.3机械牵伸对细胞增殖的影响在不同牵伸时间（1天、2天、3天）的各组中，牵伸应变量为4%时，对细胞增殖影响不显著；牵伸应变量为8%时，细胞增殖降低，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）。1.3小结1.3.1一定的机械牵伸可使TSCs中BMP2和Runx2表达上调。1.3.2BMP2和Runx2表达水平随牵伸强度的增加而增加。1.3.3在不同牵伸时间点，4%牵伸强度对TSCs增殖影响不显著，8%牵伸强度使TSCs增殖降低，4%与8%牵伸强度之间可能为“适度牵伸”与“过度牵伸”的临界点。2.不同机械牵伸条件对TSCs中RhoA/ROCK信号分子表达的影响2.1分别从基因表达和蛋白表达两个方面着手，研究TSCs在不同牵伸条件下，RhoA、ROCK分子的表达水平及变化趋势。2.2实验结果2.2.1机械牵伸对TSCs中RhoA、ROCK基因表达水平的影响在不同牵伸时间(1天、2天、3天)的各组中，RhoA、ROCK基因表达均随牵伸强度的增加呈递增趋势；具有统计学差异（P＜0.05）。2.2.2机械牵伸对TSCs中RhoA、ROCK蛋白表达的影响在牵伸1天后，不同应变量下RhoA、ROCK蛋白表达水平变化不显著（P＞0.05），牵伸2天、3天后，4%、8%牵伸应变量与对照组相比，RhoA、ROCK蛋白表达呈递增趋势（P＜0.05）。2.3小结2.3.1机械牵伸可使TSCs中RhoA和ROCK信号分子表达上调。2.3.2RhoA和ROCK表达水平随牵伸强度增加而上升。3.抑制RhoA/ROCK信号分子对牵伸诱导的TSCs成骨分化的影响。3.1在牵伸条件下，从基因表达方面，研究RhoA、ROCK分子对TSCs成骨分化指标Runx2表达的影响。3.1.1实验条件及分组牵伸应变量为8%；牵伸频率为1Hz；牵伸时间为4h/d，牵伸3d；实验分组：TSCs不牵伸；TSCs+牵伸；TSCs+C3毒素+牵伸；TSCs+Y27632+牵伸3.1.2收集细胞进行Real-time PCR检测。3.2实验结果3.2.1TSCs在8%牵伸强度，4h/d，连续牵伸3天条件下成骨分化相关因子Runx2基因表达增加。3.2.2加入RhoA抑制剂C3毒素的TSCs在上述条件牵伸后Runx2基因表达较没有添加C3毒素组下调。3.2.3加入ROCK抑制剂Y27632的TSCs在上述条件牵伸后Runx2基因表达较没有添加Y27632毒素组下调。3.3小结3.3.1C3毒素抑制RhoA后，可使机械牵伸诱导的TSCs成骨分化相关因子表达水平下降。3.3.2Y27632抑制ROCK后，可使机械牵伸诱导的TSCs成骨分化相关因子表达水平下降。3.3.3RhoA/ROCK分子在机械牵伸诱导的TSCs成骨分化中起着重要作用。总结机械牵伸可使TSCs成骨分化的标志物表达上升，并且随牵伸强度的增加而增加，RhoA/ROCK信号分子在TSCs异常成骨分化中起到了一定的作用，可能成为肌腱病防治研究的新的信号分子。