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研究目的:1.探究瘢痕疙瘩组织中细胞凋亡和增殖的状态,同时与浅表性瘢痕组织、正常皮肤组织进行比较。2.明确2ME2对瘢痕疙瘩成纤维细胞的浓度-时间-效应曲线,进而得出2ME2的IC50浓度和作用时间。3.明确2ME2的IC50浓度和作用时间对正常皮肤成纤维细胞活性的影响。4.进一步明确2ME2对瘢痕疙瘩成纤维细胞线粒体凋亡通路中关键因子和PCNA表达的影响,并对其可能的机制加以验证。研究方法:1.三十例患者组织标本:10例瘢痕疙瘩组织(标记组别K),10例浅表性瘢痕组织(标记组别C),10例正常皮肤组织(标记组别S)。通过H&E染色和Masson染色对组织的形态学进行观察,通过免疫组织化学染色和Western Blot技术对组织线粒体凋亡通路中关键因子及PCNA的表达进行定性和定量分析。2.三例瘢痕疙瘩标本进行细胞原代培养。实验共分为3个组别:①2ME2组(7个浓度梯度,4个作用时间点);②曲安奈德组(9个浓度梯度,3个作用时间点);③5-FU组(10个浓度梯度,3个作用时间点)。通过细胞活性检测绘制浓度-时间-效应曲线并计算获得每个组别的IC50值。3.三例瘢痕疙瘩标本和三例正常皮肤标本进行原代培养。实验共分为4个时间点,每个时间点设置6个组别:①0μM2ME2+正常皮肤成纤维细胞(标记组别0S);②0μM2ME2+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别0K);③6.975μM2ME2+正常皮肤成纤维细胞(标记组别S);④6.975μM 2ME2+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别K);⑤0.07%DMSO+正常皮肤成纤维细胞(标记组别DMSO-S);⑥0.07%DMSO+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别DMSO-K)。通过细胞活性检测,判断IC50浓度的2ME2对正常皮肤成纤维细胞活性的影响。4.六例瘢痕疙瘩标本和六例正常皮肤标本进行原代培养。实验共分为6个组别:①正常皮肤成纤维细胞(标记组别S);②瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别K);③6.975μM2ME2+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别2ME2);④0.07%DMSO+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别DMSO);⑤8μMAc-DEVD-CHO+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别IN);⑥8μMAc-DEVD-CHO+6.975μM药物+瘢痕疙瘩成纤维细胞(标记组别IN+2ME2)。药物作用48小时后,对细胞活性进行检测。药物作用24小时后,通过TUNEL凋亡染色来观察成纤维细胞的形态学改变,通过细胞免疫荧光染色和Western Blot技术对成纤维细胞线粒体凋亡通路中关键因子及PCNA的表达进行定性和定量分析。研究结果:1.瘢痕疙瘩组织中有少量炎性细胞浸润,表皮较厚,真皮组织排列结构紊乱;浅表性瘢痕组织真皮胶原排列规则;正常皮肤组织表皮最薄,真皮胶原排列疏松。瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织相比,caspase-3的相对表达量显著升高;瘢痕疙瘩组caspase-8的相对表达量较其他两组显著升高;但是在其他因子表达和Bcl-2/Bax比值方面,三组间却无显著性差异。在PCNA的Western Blot结果中,瘢痕疙瘩组织PCNA的相对表达量显著高于浅表性瘢痕组和正常皮肤组。2.2ME2最佳IC50值为6.975μM,作用时间为48h;5-FU最佳IC50值为5520μM,作用时间为48h;曲安奈德最佳IC50值为152.4μM,作用时间为48h。3.6.975μM浓度的2ME2作用后,正常皮肤成纤维细胞的活性会有所下降,但下降幅度较为平缓,主要下降时间为用药后的6h至12h,细胞活性在2ME2作用12h、24h和48h均未见显著性改变,无继续下降趋势;在2ME2作用6h时,瘢痕疙瘩成纤维细胞活性下降较为显著,而在12h至24h之间,瘢痕疙瘩成纤维细胞活性下降略有缓和,但活性仍低于正常皮肤成纤维细胞。在48h时,正常皮肤成纤维细胞活性未出现下降趋势,而瘢痕疙瘩成纤维细胞活性降低显著。4.2ME2能够显著降低瘢痕疙瘩成纤维细胞活性且在形态学上导致了瘢痕疙瘩成纤维细胞典型的凋亡形态。除Bcl-2以外,其他所有线粒体凋亡通路关键因子在2ME2组均呈现最高的表达水平。大部分线粒体凋亡通路关键因子在K组、DMSO组和IN 组的表达水平接近。IN+2ME2 组较 2ME2 组而言,caspase-3、caspase-8、caspase-9表达显著降低。经2ME2处理后的瘢痕疙瘩成纤维细胞PCNA的表达程度显著降低。研究结论:1.瘢痕疙瘩组织的细胞凋亡整体水平与浅表性瘢痕组织、正常皮肤组织接近,而增殖水平显著增高,意味着瘢痕疙瘩组织可能处于极高的细胞增殖水平与“相对较低”的细胞凋亡水平之间的“不平衡状态”。2.本课题中2ME2、曲安奈德、5-FU的最佳作用时间均为48小时,但是2ME2的IC50浓度远小于曲安奈德和5-FU,意味着若2ME2应用于临床治疗,在达到临床疗效的前提下其药物用量远小于曲安奈德和5-FU,这也可能降低因药物用量带来的临床并发症。3.IC50浓度的2ME2对正常皮肤成纤维细胞具有一定的抑制作用,但是这种作用强度很低,且持续时间不长,由此推断临床使用2ME2对正常皮肤的影响可能并不显著。4.2ME2可以显著降低瘢痕疙瘩成纤维细胞活性,这一效应可能是通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖两方面来实现。2ME2通过影响线粒体凋亡通路中关键因子的表达来促进细胞凋亡过程,其机制有一部分是通过线粒体凋亡通路caspase依赖性途径实现的。5.IC50浓度中的DMSO不会影响瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的活性、不会影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态、线粒体细胞凋亡通路关键因子及PCNA的表达。