日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病,与西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)和登革热病毒(Dengue Virus, DENV)等同属于黄病毒科黄病毒属。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病对养猪业的危害主要表现为夏秋季节母猪的繁殖障碍与公猪的睾丸炎,在我国流行面积较大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。由于现阶段对于乙脑尚无治疗的特效手段,因此预防乙脑的发生尤为重要,而疫苗是控制该病发生的最佳手段。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在乙脑病毒上应用以来,在对乙脑病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明显进展。本研究构建了两个突变感染性克隆株(突变E138、N154)分别在细胞和动物模型上验证其毒力的变化,为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台；同时构建突变N154的重组真核质粒,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为改良核酸疫苗的潜能。研究主要从以下几方面展开：1猪源乙型脑炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析猪源乙型脑炎病毒NJ2008株是从南京某猪场流产胎儿的脑组织中分离并在BHK-21细胞上经数次传代,本实验根据乙型脑炎病毒SH0601株的基因组序列设计并合成JEV特异性引物进而应用RT-PCR技术分11段扩增了JEV NJ2008株基因,将所得片段克隆至pMD18-T载体上,经测序后获得了JEV基因组全序列。序列分析表明,该JEV基因组全长10,961bp,含有一个大的开放阅读框架,编码由3432个氨基酸残基组成的聚合蛋白,其5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别由95和578个碱基组成,与其它毒株比较发现3’非编码区(3’UTR)的44bp处共缺少16个碱基。通过全基因和E基因的进化树分析可得,猪源乙脑NJ2008株病毒属于基因Ⅲ型,该病毒的全基因与其它32株病毒核苷酸进行比较发现,同源性在99.4%和88%之间,与其它45株病毒E蛋白的核苷酸比较发现,同源性在99.2%和87.7%之间；该病毒的全基因与其它32株病毒氨基酸进行比较发现,同源性在99%和89.1%之间,与其它45株病毒E蛋白的氨基酸比较发现,同源性在99.5%和89.7%之间,突变位点分散于各个区域。与其它16株猪源乙脑病毒E蛋白的氨基酸比较发现,E蛋白的309位氨基酸发生了突变,由酪氨酸(Tyr)-丝氨酸(Ser),并且307-309位为乙型脑炎病毒E蛋白的一个B细胞线形表位。2猪源乙型脑炎病毒NJ2008株感染性克隆的构建及鉴定本实验根据猪源乙型脑炎病毒NJ2008株基因组序列设计并合成JEV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分4段扩增了JEV NJ2008株全基因组cDNA。将扩增的1、2两个片段通过重叠PCR的方法扩增出JEV 5’cDNA,将扩增的3、4两个片段通过重叠PCR的方法扩增出JEV 3’cDNA。在扩增5’前端时,引入T7启动子序列用于后期的体外转录得到病毒的转录本,在基因组5’前端和3’末段分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点,最后将5’cDNA和3’cDNA连入pBluescriptⅡKS载体,构建的质粒命名为pSK-SUP、pSK-HYP。进一步的酶切鉴定及接头处序列测定的结果表明,成功获得了NJ2008株基因组全长cDNA克隆。用SalⅠBamHⅠ双酶切质粒pSK-SUP,用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已经构建好的质粒pSK-HYPO,然后通过体外连接获得全长基因组。体外连接的全长基因组转录合成病毒RNA,转染BHK-21细胞,72h后将转染病毒RNA细胞冻溶1次后接种BHK-21细胞,拯救出病毒。通过间接免疫荧光证明病毒拯救成功,并且比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及分子生物学特性没有显著差异。通过测序分析,拯救病毒的氨基酸与亲本毒共有3个氨基酸的差异,尚没有文献报道该病毒的毒力与这3个氨基酸有关。以上结果表明JEV强毒株NJ2008株感染性克隆构建成功,建立了JEV疫苗株的反向遗传操作系统,为研究JEV的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。3猪源乙脑病毒E138位突变株感染性克隆的构建与病毒拯救日本脑炎病毒E蛋白的138位氨基酸对于该病毒的毒力强弱起到至关重要的作用,所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白138位谷氨酸(Glu)突变为赖氨酸(Lys),构建了突变株的全基因感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本感染性克隆株对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/3。另外,在小鼠脑内接种同剂量的亲本株病毒和E138突变感染性克隆病毒,接种E138突变感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。该实验将为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台。4猪源乙脑病毒NJ2008株N-糖基化位点的突变影响病毒的复制、胞内定位以及致病力日本脑炎病毒E蛋白仅含有一个糖基化位点,N154-N-T。已经有文献报道,有些病毒E蛋白糖基化位点的改变会影响病毒的形态、感染力以及免疫应答,但乙型脑炎病毒该位点的突变是否影响病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白154位天冬酰胺(Asn)突变为丙氨酸(Ala),构建了N154突变株的感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本株病毒对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/2。通过激光共聚焦显微镜观察到,在感染BHK-21细胞的早期(24h),突变N154病毒与亲本毒的蛋白在细胞内的定位有所不同,突变N154病毒的蛋白在细胞中呈现明显的聚积。突变株病毒脑内接种乳鼠,对乳鼠致病力有所下降。由此可以看出,E蛋白糖基化位点的突变降低了乙脑病毒的复制、影响了蛋白在胞内的折叠以及降低了病毒的致病力,这也将为猪源乙型脑炎病毒弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。5猪源乙脑病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建PrM和E蛋白是乙型脑炎病毒两个重要的囊膜蛋白,将prM、E基因及prM的信号肽序列插入真核表达质粒pVAXI中构建重组真核质粒pVAXI-prME,其中prM和E各含有一个糖基化位点(N15,N154),单独或联合突变其糖基化位点,将天冬酰胺(N)突变成丙氨酸(A),构建3株突变的重组真核质粒pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,重组质粒转染VERO细胞,利用间接免疫荧光证明亲本与3株突变的重组质粒在真核细胞内能有效的转录和表达；通过肽N-糖苷酶F (PNGase F)作用后,Western-blot检测表明突变糖基化位点的重组真核质粒表达产物的分子量小于亲本质粒的表达产物,并而这些重组质粒都能与JEV单克隆抗体特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。6猪源乙脑病毒prM、E蛋白N-糖基化位点对Balb/c小鼠的特异性免疫影响为了评价构建的亲本和突变重组真核质粒的免疫效力,将这4株重组真核质粒作为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。将6周龄Balb/c小鼠随机分成5组,每组14只,设pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3共4个免疫组,同时设pVAXI空载体对照组,肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为100μg/只。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体和细胞因子(IL-4,IL-2和IFN-γ),并做了攻毒保护试验来衡量突变N154的重组质粒的免疫效果。结果表明：重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,即突变E基因的N154后,既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,且体液免疫水平比pVAXI-prME高。抗体亚型分析结果表明,突变N154的重组质粒既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG1为主；同时细胞因子检测结果进一步表明突变N154的重组质粒主要诱导Th2型细胞因子(IL-4)的产生,因此说明其主要诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3色完全保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,因此通过突变E基因154位糖基化位点的DNA疫苗可以明显的提高体液免疫应答,并且可以为改良的JEV核酸疫苗提供依据。