琼胶降解菌筛选及琼胶酶分离纯化

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近年来,海藻多糖及寡糖功能食品的研究开发受到青睐,琼胶寡糖是众海洋功能性低聚糖中的一种。琼胶寡糖具有抗氧化、抗炎、抑菌、吸湿保湿美白、抑制黑色素形成、延缓衰老等生物活性。目前,制备琼胶寡糖的方法主要是酸解法和生物降解法,酸解法存在诸多弊端,而生物降解法是目前琼胶寡糖的绿色制备方法,所以其成为研究的热点。但存在的普遍问题是:琼胶酶来源少,活性低,阻碍琼胶寡糖的产业化生产。因此,筛选高产琼胶酶的菌株并对琼胶酶进行放大试验具有重要意义。以筛选降解琼胶生成琼胶寡糖的降解菌为出发点,从紫菜养殖区海水中通过富集培养、初筛、复筛筛选得到一株能降解琼胶的菌株HJPHYXJ-1。该菌为革兰氏阴性菌,16S rDNA序列同源性与需钠弧菌(Vibrio natriegens)的达到了99%;结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为需钠弧菌(Vibrio natriegens),Genbank序列号为KR181948,保藏编号为CCTCC M 2015244。通过单因素实验对菌株产酶条件进行优化,该菌株较合适的产酶条件为:接种龄8 h,接种量10%,温度30℃,培养基初始pH=6.5,培养时间42 h,酶解液中还原糖含量可达到714.00 mg×L-1,是优化前的4.79倍。采用优化后的培养条件对菌株进行培养,发酵液经冷冻离心、硫酸铵盐析、冷冻干燥得到粗酶粉,粗酶经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换、Sephacryl S-100 HR凝胶层析等柱层析分离纯化,获得电泳纯的琼胶酶;SDS-PAGE电泳分析其分子量约为33.8 kD,纯化倍数为14.36,收率为2.9%。该琼胶酶可将琼胶转化为新琼寡糖,说明该琼胶酶为β-琼胶酶。琼胶酶酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH为8.5;该酶的动力学参数Km=12.24 mg×mL-1,Vmax=0.051 mmol×(L·min)-1;该酶的底物专一性良好,对琼胶的水解效果较好,对其他多糖有水解效果差或几乎不水解。酶解液经HPLC检测:酶解产生的寡糖分子量范围在342-1962之间,是以新琼二糖为重复单位的新琼寡糖;随着酶解时间的延长,分子量小的寡糖组分所占比例提高。以Vibrio natriegens HJPHYXJ-1为出发菌株,对其进行了紫外诱变,得到了一株能够稳定遗传的突变株,突变株的酶活可达到151.85 U×mL-1,较原始菌株提高了46.30%。
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