脊椎动物器宫在发育过程中的形态发生和细胞分化都是由上皮细胞和外胚间充质细胞的相互作用所调控的。牙胚的形成被认为是研究上皮间充质相互作用、器官发育的最理想模型。上皮间充质之间如何进行信息传递，促使细胞向不同方向移行、分化，都是受机体内环境和整体调控基因控制的。目前研究认为一些生物分子在时间，空间，活性强度等方面有序的协调作用决定了牙齿发育的进程。这些调控牙胚发育的信号分子主要有转录因子及生长因子。其中一类转录因子通过同源域（homeodonain）结合特定的DNA序列，这种特殊的转录因子都包含一个同源盒（homeobox），它有180bp序列可以编码DNA结合同源域，称同源盒基因（Homeobox gene，Hox gene），带有同源框的基因经过转录产生带有同源域的蛋白质。后者作为DNA结合蛋白在胚胎发育中起转录因子的作用，启动或抑制控制发育过程的其他基因，进而决定动物前后体轴上不同部位的细胞命运。同源异型盒基因的发现，是生物发育学的一个重大突破，它使生物发育学在分子水平上大大前进了一步。研究表明，Dlx基因家族在牙胚发育过程中起着重要的调控作用，本实验旨从细胞和分子水平探讨Dlx基因在未分化外胚间充质细胞及牙胚发育中的调控作用，主要研究内容及结果如下： 一．Dlx1、Dlx2基因在牙胚发育不同时期的表达研究 采用原位杂交方法，观察牙胚发育不同时期各种组织细胞中Dlx1和Dlx2基因的表达情况。蕾状期：Dlx1和Dlx2在成釉器中央细胞及周围外胚间充质细胞为阳性表达。帽状期：Dlx1和Dlx2在内釉上皮、星网层、外釉上皮、间充质牙乳头细胞中表达。钟状早期：Dlx1和Dlx2在外釉上皮、内釉上皮、星网层、牙乳头细胞、成牙本质细胞阳性表达。钟状晚期：Dlx1不表达；Dlx2在外釉上皮，星网层、中间层、成釉细胞，牙乳头细胞、成牙本质细胞、牙本质基质中表达。表明，Dlx基因可能调控早期胚胎细胞生长分化，促使牙胚发育，并且这种调控作用有一定的时空特异性。 二．Dlx1、Dlx2基因在外胚间充质细胞中的表达 第四军医大学博士学位论文 组织块培养法培养了大鼠上颌突外胚间充质细胞，细胞来源鉴定说明体外培养的细胞基本保持体内未分化状态，以便在体外对其增殖、分化特性及功能进行研究。采用原位杂交和斑点杂交方法比较外胚间充质细胞、牙乳头细胞、牙髓成纤维细胞中 DIXI和 DIXZ基因的表达，结果表明，Dhl和 DtrZ基因在外胚间充质细胞、牙乳头细胞中InRN表达高于牙髓成纤维细胞。提示DIX基因主要参与调控早期未分化细胞，而对终末分化细胞作用不显著。 三．反义DIXI、DIXZ基因真核表达载体的构建及在外胚间充质细胞的稳定表达 为研究＊ 基因对外胚间充质细胞的调控作用，本实验分别构建了pCDNA3，1（－）／DIXI、pEGSHfDIXZ基因反义 RNA真核表达载体，并利用脂质体介导法转染外胚间充质细胞，加压筛选，挑选抗性基因克隆细胞株，扩增培养，获得稳定表达反义 DIXI和 DIXZ的外胚间充质细胞。 四．转染反义DIXI和DIXZ基因对外胚间充质细胞的调控作用 采用原位杂交及免疫组化方法研究Dtr基因对外胚间充质细胞分化的调控作用，稳定表达反义 Dtrl和 DtrZ基因的外胚间充质细胞中 S。Xg基因的表达和 al（11）胶原的表达增强，提示稳定表达反义 Dlx和 DtrZ的外胚间充质细胞具有软骨细胞的表型特征，进一步说明外胚间充质细胞通过开启不同的基因表达通道而向不同的细胞方向分化，并且推测S。Xg基因可能是＊ 基因的下游基因。 五．生长因子及维甲酸对外胚间充质细胞及体外培养牙胚中DIXI、DIXZ基因的调控作用 采用斑点杂交方法研究FGFZ、EGF、BMPZ、维甲酸对体外培养的外胚间充质细胞中DIXI、DIXZ基因的调控作用，发现FGFZ、维甲酸可以刺激DIXI和 DIXZ的表达；BMP。可以诱导 DtrZ的表达，而对Dtrl无作用；EGF对Dk1、DIXZ基因的表达无影响。表明Dtr基因受多种生长因子及激素的调控，并且这些信号分子的调控机制不同。进一步采用体外牙胚培养观察到FGFZ能够促进牙胚发育、细胞分化，但FGF。作用下培养的牙胚与对照组牙胚中 Dirl和 DlxZ ·3· 第四军医大学博士学位论文基因的表达无任何影响。表明FGF。在牙胚发育中对Dtr基因表达调控具有一定的时间与空间特性。 本研究通过对 DIXI和 DtrZ基因在不同发育时期牙胚组织及外胚间充质细胞中的表达研究，证实了Dh基因以一种复杂的时空模式调节牙胚发育。进一步揭示，基因调控在牙胚发育期间有层次地协调活动说明了有限数量的基因可以以精确和一致的方式来调节牙胚发育。任何基因水平的突变都将导致牙齿发育的畸形或缺失，因此，深入了解DI－X等转录因子与BW、EGF、TGF－e、FGF等生长因子在牙胚发育中基因表达调控机制及相互关系，对于研究牙齿形态发生，牙胚形成