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背景胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,易侵袭转移是胃癌重要的病理学特征,也是其治疗困难,预后不佳的主要原因之一。近年来临床研究发现白细胞介素8(IL-8)在胃癌中呈高表达,表达水平与胃癌浸润深度、淋巴结转移以及预后等密切相关[1-2]。导师魏品康教授以“消痰散结”为法则,创立消痰散结方应用于胃癌的临床治疗,取得了令人满意的疗效,其可较好的减少肿瘤的转移,阻止肿瘤的发展。因此,本实验通过观察IL-8在胃癌细胞黏附力、侵袭力以及胞外基质降解等方面作用,进一步探讨IL-8在促进胃癌细胞侵袭中的作用机制,同时用消痰散结方进行体内、体外实验干预,观察其对IL-8表达水平以及对IL-8在胃癌侵袭过程中作用的影响,探讨消痰散结方抗胃癌侵袭的可能作用机制。目的通过应用重组人IL-8干预体外培养的人胃癌细胞SGC7901,检测胃癌细胞黏附和侵袭力及相关基质金属蛋白酶和黏附分子表达的变化,探讨其在胃癌侵袭过程中的生物学作用;消痰散结方中药血清干预IL-8培养的人胃癌细胞以及消痰散结方干预胃癌荷瘤鼠,检测胃癌细胞的黏附和侵袭力等变化以及胃癌组织中IL-8及其受体等表达变化,探讨消痰散结方在抗胃癌侵袭中的可能作用机制。方法1、IL-8对人胃癌细胞侵袭相关生物学因素的影响:(1)ELISA方法检测体外培养的人胃癌细胞SGC7901在24h、48h和72h的IL-8蛋白表达水平。(2)将体外培养的胃癌细胞给予不同浓度的rIL-8(0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)培养干预,CCK-8方法检测胃癌细胞增殖以及与血管内皮细胞和胞外基质的黏附能力;划痕修复实验检测胃癌细胞迁移力;Transwell方法检测胃癌细胞侵袭力;Westenblot和RT-PCR方法检测MMP-2、MMP-9和E-cad、ICAM-1蛋白和基因表达变化。2、消痰散结方干预IL-8在人胃癌细胞侵袭中作用的研究:(1)制备消痰散结方中药血清和空白对照药物血清。CCK-8方法观察消痰散结方中药血清对胃癌细胞增殖和IL-8蛋白表达的影响。(2)将rIL-8(100ng/ml)培养处理的胃癌细胞,给予消痰散结方中药血清干预,CCK-8方法检测消痰散结方中药血清干预IL-8对胃癌细胞与血管内皮细胞和胞外基质的黏附能力的作用;划痕修复实验检测胃癌细胞迁移力的变化;Transwell方法检测胃癌细胞侵袭力的变化;Westenblot和RT-PCR方法检MMP-9和E-cad、ICAM-1蛋白和基因表达变化。3、消痰散结方对人胃癌裸鼠皮下移植瘤中IL-8及受体蛋白表达的影响:建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、消痰散结方组;术后48h后各荷瘤鼠灌胃给药(0.4ml,1次/日,6次/周,34w);观察实验动物全身情况、体重变化;实验4周后,处死荷瘤鼠,称取瘤重;透射电镜观察胃癌组织的超微结构;运用ELISA法、SABC免疫组织化学法分别检测胃癌组织中IL-8和受体CXCR1、CXCR2蛋白以及MVD(CD34标记)表达水平。结果1、人胃癌细胞SGC7901中有IL-8蛋白的表达,而且随着培养时间的增加,IL-8的表达浓度逐渐增加,连续培养72h时,胃癌细胞中IL-8的蛋白浓度达到(277.476±26.650)pg/ml,与24h和48h比较,差别具有统计学意义(P<0.01)。2、CCK-8检测结果提示:rIL-8对人胃癌细胞SGC7901未见明显增殖作用(P=0.995);rIl-8可以促进人胃癌细胞SGC7901与内皮细胞的黏附,组间比较差异具有统计学意义(P <0.01),rIL-8可以促进胃癌细胞与胞外基质成份(collagen, laminin和fibronectin)的黏附作用,组间比较差异均具有统计学意义(P <0.01,P <0.01,P <0.01),并且人胃癌细胞与内皮细胞和胞外基质成份的黏附作用随着rIl-8干预浓度的增加而增强,均呈现浓度依赖的递增趋势。3、划痕修复实验结果提示:rIL-8干预的胃癌细胞24h内迁移的速度明显增强。而且迁移能力随rIL-8浓度的递增而明显增强;Transwell实验结果提示:rIL-8可提高胃癌细胞的侵袭能力,促进胃癌细胞的侵袭移动,随着rIL-8干预浓度的增加,穿过Matrigel基质膜的胃癌细胞数明显增多,组间两两比较差别均具有统计学意义(P <0.01)。4、Westenblot和RT-PCR结果提示:在不同浓度的rIL-8干预下MMP-2的蛋白及其mRNA表达未见明显改变;而MMP-9和ICAM-1的蛋白及其mRNA表达随rIL-8干预浓度增加而表达明显增高,E-cad的蛋白及其mRNA表达水平随着rIL-8浓度的增加而逐渐降低,表达改变与rIL-8具有浓度依赖关系。5、消痰散结方中药血清干预实验结果提示:消痰散结方中药血清可以明显降低IL-8蛋白的表达水平,与对照组和空白药物血清组比较差异均具有统计学意义(P <0.01,P <0.01),而空白药物血清与对照组相比可促进IL-8蛋白的表达水平(P <0.05);消痰散结方中药血清与对照组和空白药物血清组相比,可抑制胃癌细胞的增殖,差异具有统计学意义(P <0.01,P <0.01),空白药物血清与对照组比较差异无统计学意义。6、以rIL-8(100 ng/ml)干预培养人胃癌细胞SGC7901,给予消痰散结方中药血清干预:(1)消痰散结方中药血清可明显抑制rIL-8对胃癌细胞与内皮细胞和胞外基质成份(collagen,laminin和fibronectin)的促黏附作用,与对照组和空白药物血清组比较差异具有统计学意义。(2)中药血清可明显抑制rIL-8对胃癌细胞24h内迁移力的促进作用;Transwell实验结果提示:中药血清可抑制rIL-8对胃癌细胞的侵袭能力的促进作用,穿过Matrigel基质膜的胃癌细胞数明显减少,与对照组和空白药物血清组比较差异具有统计学意义(P <0.01,P <0.01)。(3)中药血清可较好抑制rIL-8对胃癌细胞中MMP-9、ICAM-1和E-cad的蛋白及其mRNA表达的调控作用。7、消痰散结方对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用:20只造模裸鼠,右侧腋下均有移植瘤生长。实验结束时,计算荷瘤鼠去瘤体重变化△W,对照组和消痰散结方组比较,二者差别无统计学意义(P>0.05);消痰散结方组瘤重明显小于对照组,二者差别有统计学意义(P<0.05)。8、消痰散结方对胃癌组织超微结构的影响:对照组染色质浓缩呈环形状,胞质中含有少量空泡,细胞膜完整,肿瘤细胞有少量伪足,胞外基质结构损伤严重,细胞骨架松散,基底膜溶解破坏;消痰散结方组可见细胞核固缩,呈团块状分布,呈凋亡状态,肿瘤细胞未见明显伪足,肿瘤细胞胞外基质结构有中等程度的损伤。9、消痰散结方对胃癌组织中IL-8及其受体以及微血管密度的影响:消痰散结方可较好下调肿瘤组织中IL-8和受体CXCR1和CXCR2蛋白的表达水平,与对照组比较二者差别有统计学意义(P <0.01);消痰散结方组可显著降低肿瘤组织中MVD计数,二者差别有统计意义(P <0.01);对照组荷瘤鼠移植瘤中IL-8蛋白表达水平与MVD计数存在高度相关性(r=0.788,P=0.007)。结论1、IL-8可以促进人胃癌细胞SGC7901黏附和迁移侵袭力,调节MMP-9、E-cad和ICAM-1的表达水平,是其促进胃癌细胞侵袭的可能分子机制;2、消痰散结方中药血清可以抑制胃癌细胞中IL-8蛋白的表达水平,可明显抑制IL-8对胃癌细胞黏附和和迁移侵袭力的促进作用以及胃癌细胞中MMP-9、E-cad和ICAM-1表达的调控作用;消痰散结方可抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,下调胃癌组织中IL-8及其受体CXCR1和CXCR2的蛋白表达和微血管密度计数水平;3、消痰散结方可调节胃癌中IL-8和其受体的表达水平及抑制IL-8促侵袭的生物学作用,是消痰散结方抑制胃癌侵袭的可能作用机制之一。