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目的肝硬化及终末期肝病患者通常存在不同程度的脑水肿,血氨的升高促进了肝性脑病的发生。脑水肿使颅内压升高,二者的恶性循环使患者预后不佳。而目前,临床对其治疗非常有限。水通道蛋白(AQP)是膜水通道蛋白家族,为调节细胞水平衡的选择性孔道,其中AQP-4在大脑中分布广泛,它在脑内的研究成为近年来的研究热点,增加对其了解可能为临床脑水肿的治疗提供新的方案。本研究拟应用肝硬化动物模型,给予氨负荷,研究水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表达与脑水肿的关系。材料与方法实验动物为健康雄性(SD)大鼠,随机分为4组:(1)正常组:不加外界干预因素;(2)正常氨负荷组:实验末给予氨负荷;(3)肝硬化组:腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液制备肝硬化动物模型,注药时间为12周,实验末不加外界干预因素;(4)肝硬化氨负荷组:制备肝硬化模型,方法同肝硬化组,实验末给予氨负荷。1、血氨的检测:各组大鼠在给予氨负荷前及氨负荷30分钟后分别经内眦静脉采血1ml,并在半小时内应用vitors AMON干片比色法测定血氨值。2、血脑屏障通透性的检测:处死动物前2小时尾静脉注射伊文思蓝溶液,取脑组织溶于甲酰胺,离心取上清液于波长632nm进行比色,根据标准曲线计算出脑组织EB含量,以此评价BBB通透性的变化。3、脑水含量的检测:处死大鼠后,完整取出脑组织,干湿重法检测脑水含量。4、HE染色观察肝、脑组织切片:2小时后处死大鼠,立即取大脑及肝右叶组织,应用4%多聚甲醛固定。常规HE染色,显微镜下观察肝脏和脑组织情况。5、RT-PCR方法检测AQP-4 mRNA表达:总RNA提取、逆转录反应、PCR扩增、PCR产物电泳。6、免疫组化法检测脑组织AQP-4蛋白:取材、固定、组织块脱水透明、石蜡包埋、切片、染色、封片。7、所有数据均以(?)±s表示,应用SPSS11.0软件进行方差分析,p值小于0.05认为差异有统计学意义。结果1、肝硬化氨负荷组中5只大鼠角膜反射与翻转反射消失;正常组、正常氨负荷组及肝硬化组角膜反射与翻转反射存在。肝硬化组4只大鼠有腹水生成,肝硬化氨负荷组6只大鼠有腹水生成。显微镜下观察:肝硬化组及肝硬化氨负荷组大鼠肝小叶结构破坏,纤维组织增生,有明显硬化结节形成,而正常组及正常氨负荷组未见上述表现。四组大鼠脑组织大体标本未见异常。2、血氨检测结果:给药前,肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠与正常组及正常氨负荷组大鼠相比,血氨水平明显升高,经检验P＜0.05;给药后,肝硬化氨负荷组血氨进一步升高,分别与其他三组相比,P＜0.05;肝硬化组血氨水平仍高于正常组及正常氨负荷组,经检验P＜0.05,有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。3、血脑屏障通透性及脑水含量检测结果:肝硬化氨负荷组大鼠脑内EB含量分别与正常组、正常氨负荷组及肝硬化组相比显著增高,最高值达到1.9890 ug/g,经检验P＜0.05,有统计学差异;其他三组间经比较,P＞0.05,无统计学差异。肝硬化组及肝硬化氨负荷组大鼠脑内水含量分别与正常组、正常氨负荷组相比明显增高,P＜0.05,有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠脑内水含量与肝硬化组相比,P＜0.05,亦具有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。4、AQP-4mRNA及蛋白表达检测结果:肝硬化及肝硬化氨负荷组可见清晰电泳条带,正常组及正常氨负荷组电泳条带模糊不清。肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠脑组织AQP-4mRNA积分光密度(ID)的表达显著高于正常组及正常氨负荷组,这两组分别与正常组及正常氨负荷组相比,P＜0.05,均有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠AQP-4mRNA积分光密度最高值达1.5100,高于肝硬化组,两组相比P＜0.05,有统计学差异。正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。四组大鼠脑组织免疫组化染色均可见AQP-4表达。肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠脑组织AQP-4较正常组及正常氨负荷组染色强度深,染色面积大。经灰度值测定后可发现:肝硬化及肝硬化氨负荷组灰度值明显低于正常组及正常氨负荷组,肝硬化及肝硬化氨负荷组与正常组及正常氨负荷组相比,P＜0.05,有统计学差异;肝硬化氨负荷组大鼠灰度值低于肝硬化组,两组相比P＜0.05,亦有统计学差异;正常组与正常氨负荷组相比,P＞0.05,无统计学差异。结论1、腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液可制备肝硬化动物模型。2、肝硬化动物模型存在氨代谢紊乱,给予高氨诱导后,血氨水平进一步升高,提示血氨可能在肝性脑病的发生中起重要作用。3、肝硬化动物模型中,BBB通透性增加,脑水含量增加,AQP-4蛋白表达显著升高,在肝硬化氨负荷组动物模型中,三者表达同步升高,推测AQP-4可能参与了脑水肿发生发展过程。4、肝硬化动物模型中,AQP-4mRNA及蛋白表达均升高,推测AQP-4mRNA可能是调节AQP-4蛋白表达的机制之一。