利用诱捕策略获得抗PVY的PBS1基因的研究

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1.马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯的主要病害,其感染引起马铃薯退化及减产。在模式植物拟南芥中报道了AvrPphB-PBS1-RPS5抗病防御系统,而马铃薯中未见报道。本论文中我们克隆到马铃薯中的StPBS1基因。特异性的改造StPBS1蛋白上AvrPphB识别切割位点为PVY病毒编码的蛋白酶NIa-Pro的切割位点。改造的StPBS1通过识别NIa-Pro来引发对PVY的免疫反应,因此被命名为诱捕策略。通过改造的StPBS1的遗传转化获得了抗PVY转基因马铃薯,为马铃薯的抗PVY基因工程提供了一种新的策略。首先在马铃薯叶片接种分泌AvrPphB效应因子的假单胞杆菌来验证了马铃薯中AvrPphB引发的免疫系统的存在。通过本地blast及蛋白序列分析发现马铃薯中存在与AtPBS1高度同源的StPBS1基因,且StPBS1蛋白的AvrPphB切割位点等基序极度保守。在本氏烟草瞬时表达体系中证实StPBS1的STKPQ基序改造为SEMPH的StPBS1R与StRPS5,Hv PBR1,Ta PBR1,StPBR1共表达能够诱导叶片坏死,说明这四个R基因可能为StPBS1R的下游基因。对StPBS1R的作用机理进行研究时发现StPBS1R的C端足以激活StPBR1引起HR,而Ta PBR1诱导的超敏反应需要StPBS1R的N端与C端的同时存在。接下来将StPBS1改造为识别NIa-Pro的StPBS1NR和StPBS1NIa。亚细胞定位结果显示StPBS1的诱捕改造并不影响其细胞膜定位,且在马铃薯叶片瞬时表达结果中引起PVY侵染后的HR反应而抑制PVY病毒的扩散。通过农杆菌介导的叶圆盘转化法获得多株马铃薯转化幼苗,包括12个StPBS1转化株系,6个StPBS1NR转化株系,3个StPBS1NIa转化株系。与野生型植株相比,三种转基因植株的PVY侵染症状都明显减轻,RT-qPCR检测结果表明PVY的病毒滴度在StPBS1与StPBS1NIa转基因植株中显著降低,说明转StPBS1与StPBS1NIa基因的马铃薯株系获得了PVY的抗性。
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