论文部分内容阅读
和其他恶性肿瘤一样,脂质合成途径异常激活,胞内脂质新生是肝细胞癌的基本代谢特征之一。作为参与肿瘤细胞脂质新生的关键转录因子——胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)成员nSREBP1a可以直接参与转录多种脂质新生途径关键酶(FASN,ACC,ACLY,SCD1,HMGCR等)基因,调节胞内脂代谢,影响细胞的正常分化及生长。本课题进行了一系列体内及体外实验,研究一种关键的蛋白精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferase,PRMTs)成员——PRMT5通过调节nSREBP1a影响肝癌细胞脂代谢及生物学行为的分子机制。本研究通过质谱分析、免疫共沉淀、GST pull down、蛋白荧光共定位等实验技术,发现并证实nSREBP1a可直接与PRMT5结合,两者的相互作用依赖PRMT5酶活域。通过体内及体外甲基化分析及后续的蛋白免疫印记分析技术,证实在PRMT5的酶活性作用下,nSREBP1a的321位精氨酸可被对称双甲基化修饰,进而抑制了GSK3β介导的430位丝氨酸磷酸化及后续与泛素化复合物FBW7的结合,从而阻断nSREBP1a蛋白的泛素化修饰及蛋白酶体水解途径,增强nSREBP1a蛋白稳定性及转录活性,促进其下游多种脂质新生关键酶的mRNA转录。通过油红O染色、甘油三酯检测及代谢质谱分析技术,证实PRMT5可以通过对称双甲基化修饰nSREBP1a的321位精氨酸,增加肝癌细胞HEPG2胞内脂质生成。通过体外细胞增殖实验、软琼脂克隆形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤模型的构建及分析,证实无论是在体内和体外,PRMT5对nSREBP1a蛋白321位精氨酸的对称双甲基化修饰,均可促进HEPG2细胞的增殖。同时,通过免疫共沉淀、蛋白免疫印记分析等实验技术,还证实内皮生长因子(Endothelial cell Growth Factor,EGF)/内皮生长因子受体(Endothelial cell Growth Factor Receptor,EGFR)途径的激活可以促进PRMT5与nSREBP1a在细胞内的结合,促进PRMT5对nSREBP1a的精氨酸对称双甲基化修饰,最终增强nSREBP1a蛋白表达。最后,对90例含正常对照肝脏组织HCC病人的肝癌组织芯片进行的免疫组化染色,结果提示肝细胞癌原位肿瘤组织的nSREBP1a的321R精氨酸对称甲基化水平明显高于正常肝脏组织,并且原发肝细胞癌组织的nSREBP1a的321R精氨酸对称甲基化水平与原发肿瘤大小呈正相关,与病人的总体生存率呈负相关。综上所述,EGF/EGFR通路的过度活化,可以使PRMT5与nSREBP1a结合,并促进PRMT5对nSREBP1a蛋白321位精氨酸位点的对称双甲基化修饰,进而增强其转录活性及下游的脂质新生,促进脂质在肝癌细胞内积聚,使其快速增殖并发生不良转归。这也意味着,对某些存在脂质新生途径过度激活的恶性肿瘤,PRMT5引起的nSREBP1a蛋白321位精氨酸的对称双甲基化有可能成为肿瘤治疗的关键靶向通路。