DMD和BMD是一组X连锁隐性遗传的神经肌肉系统疾病，特点是进行性加重的肌肉萎缩与无力。发病率为活产男婴的1/3500。该病发病率高，危害大，为遗传病研究中的重点之一。至今尚无有效的治疗方法，故及时确诊患者、检出携带者和进行产前诊断成为降低本病的最重要措施。 DMD基因定位于人类X染色体短臂Xp21上，长度为2500kb，由79个外显子和78个内含子构成。基因的编码产物为抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，是一种分子量为427kD的糖蛋白，位于骨骼肌细胞膜内，对于维持肌细胞的骨架结构、保持膜内外钙离子的正常浓度至关重要。DMD基因具有突变频率高且突变形式多样之特点。早期研究发现，基因突变中缺失占55％-65％，点突变占25％左右，重复占5％-10％，其它微小缺失和微小重复占8％左右。可见DMD基因的部分或全部缺失为该病的重要病因之一。该基因通常断裂发生于内含子中，而导致断裂点之间一个或几个外显子的缺失。DMD基因缺失集中在两个热点区域：一个在该基因的5’端，包括外显子2-20，占总缺失的30％；另一个在中央区，包括外显子44-53，占总缺失的70％。基因缺失的位置和大小无固定规律。鉴于这种特点，其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。 目前国内外许多单位均已开展了DMD基因诊断，对基因缺失的检 第四军医大学硕士学位论文测主要是通过用cDNA探针的Southern印迹或用经典引物的PCR方法进行的。尽管这些方法应用很广泛，但它们也有一定的局限性，不能对大量可能缺失的片段同时进行检测。DNA微阵列技术则可以用来同时检测大量外显子信息。微阵列所包含的外显子信息量越大，其优越性越明显，突出表现为检出率的提高和克服了PCR选择引物的盲目性。 本实验分为基础研究和临床研究两部分。基础研究致力于外显子探针的制备（基因工程的方法）和DNA微阵列的研制（合成后点样法）；临床研究则应用DNA微阵列技术检测临床患者的DMD基因缺失倩况。具体实验方法和结果如下： 1．由健康人外周静脉血白细胞提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，应用 Chamberlain等和 Beggs等设计的 18对引物，对 DMD基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGE炉1 E卿载体连接，转化ECOli JM109感受态细胞。通过平板培养，挑选阳性克隆。提取重组质粒，Not酶切，获得完整的克隆片段，并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。克隆和测序结果说明，扩增到的产物确为DMD基因外显子 4、44、12、8、sl、17、19、48、45、52、60、47、6、13、50、43、3、49片段，与己报道的序列具有极高的相似性。这些片段长度分别为196、268、331、360． 388、416、459、506、547、113、139。181、202、238、271、357、410、439hp。通过上述基因工程的方法可以大量制备这些外显子片段，并为DNA微阵列的研制做好了探针方面的准备。 2．以此克隆产物作为检测DMD基因常见易缺失外显子的核昔酸探针。在NC膜上固定探针，标记扩增待检样品，进行传统的反向斑点杂交试验。初步验证了探针的特异性。 3．用APESs＊yLyS对普通载玻片进行处理（分别用APESIOlyLyS单独处理，以及用APES和POlyLyS共同处理）后，固定FITC荧光标记的人类基因组 DNA随机扩增样品，以不同浓度的盐溶液（dHO，PBSpH7．4，0＊XSSC，ZXSSC，SXSSC）冲洗。测定玻片的不同处理方式和洗涤方式对固定的核酸样品牢固性的影响程度。结果表明，核酸样品都 一6一 第四军医大学硕士学位论文会在洗涤过程中有所脱落，其程度随着溶液盐浓度的增加而增大：不同处理的玻片在核酸固定效率上略有差别，以APES和POlyLyS联合处理的玻片固定效率最高。 4．以 APES和 POly－LyS联合处理的玻片为固相支持物，以克隆得到的 18个 DMD基因常见易缺失外显子片段为探针，利用点样法制备简易微阵列。另设 8－acin的 DNA片段为阳性对照，pUC gffiCORI的 DNA片段为阴性对照。共 20个点，组成 5 X 4阵列。对待检的核酸样品进行ienow法随机引物扩增，同时掺入FITC荧光标记dUTP。用荧光显微镜观察微阵列杂交后荧光信号的分布，缺乏荧光信号的点提示该点所包含的基因片段在待检样品中缺失。 5．应用DNA微阵列技术对临床收集的30例DMD＄MD、l例面肩肪型肌营养不良、2例强直性肌营养不良、二例遗传性痉挛性截瘫患者和5例正常人进行DMD基因缺失型突变检测。结果显示：30例DMD用MD患者中有 ZI例至少存在一个外显子片段缺失，占 70％；9例未被检测到缺失。ZI例缺失型突变中单个外显子缺失和多个外显子连续型缺失分别为二例和 10例，非连续型缺失为 9例。具有外显子缺失的患者中，11例缺失部位集中于第44－53号外显子，5例集中于第2－20号外显子，5例在以上两个区域均有缺失。其中 45、sl号外显子缺失频率最高，44、48