目的:研究补肾法、疏肝法对人子宫内膜微血管内皮细胞增殖、迁移的影响及其促进血管新生的作用,探讨两法改善子宫内膜容受性的作用机制,并比较补肾法与疏肝法的异同。方法:1人子宫内膜微血管内皮细胞的培养人子宫内膜微血管内皮细胞(Human endometrial microvascular endothelial cells,HEMEC)用含10%胎牛血清的ECM培养基在37℃、5%CO2培养箱孵育,待细胞长满培养瓶90%左右时用0.25%胰酶传代,传代后用于实验。2含药血清制备选取12名年龄在20~30周岁,身体健康的女性志愿者,签订知情同意书。将12人随机分为3组。其中补肾组和疏肝组分别口服补肾助孕方和逍遥丸3天,于第4日晨起空腹服用全天剂量,1h后静脉取血5ml。正常组常规饮食,第4天清晨空腹静脉采血5ml。室温静置,离心取上清,56℃水浴灭活补体,过滤除菌,得补肾助孕方、逍遥丸人含药血清和正常人血清,-20℃保存备用。3分组3.1常规传代内皮细胞,低血清培养24小时。40ng/ml的VEGF刺激细胞不同时间(0h、6h、12h、24h),检测细胞VEGFR-2以及增殖相关指标PCNA、细胞周期相关基因CyclinD1、迁移相关指标MMP9的蛋白和mRNA水平;CCK8法检测内皮细胞的增殖能力;细胞划痕法观察内皮细胞的迁移能力;内皮细胞株小管形成实验观察VEGF对血管生成的影响。给予VEGF(40ng/ml)孵育细胞短时间点(0min、15min、30min、60min),检测MAPK信号通路(p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38、P38)的变化。3.2传代内皮细胞,低血清培养24h后,分别给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,实验分组具体为:对照组、VEGF组、补肾组、疏肝组。检测VEGF和VEGFr-2的蛋白和mrna水平,观察补肾法和疏肝法对VEGF和VEGFr-2的影响。3.3传代内皮细胞,低血清培养24h后,分别给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,再给予VEGF(40ng/ml)刺激内皮细胞,分组具体为:对照组、VEGF组、补肾组、补肾+VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组,观察增殖迁移指标及相关信号通路指标的变化;cck8法检测内皮细胞的增殖能力;细胞划痕法观察内皮细胞的迁移能力;内皮细胞株小管形成实验观察补肾法和疏肝法对血管生成的影响。阐明补肾法和疏肝法对内皮细胞增殖迁移的影响,并比较两者之异同。3.4传代内皮细胞,低血清培养24h后,给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,再用erk通路抑制剂pd98059、jnk通路抑制剂sp600125和p38通路抑制剂sb203580分别孵育细胞2h,再给予VEGF(40ng/ml)刺激内皮细胞,具体分组如下:对照组、VEGF组、抑制剂+VEGF组、补肾组(疏肝组)、补肾+VEGF组(疏肝+VEGF组)、补肾+抑制剂+VEGF组(疏肝+抑制剂+VEGF组),检测内皮细胞增殖、迁移与mapk信号通路的相关指标。阐明补肾法及疏肝法通过哪条信号通路影响内皮细胞增殖迁移,并比较两者之异同。4检测方法采用westernblot法检测VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9、erk、p-erk、jnk、p-jnk、p38、p-p38蛋白的表达;采用realtimepcr法检测VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9mrna的表达;cck8法检测内皮细胞的增殖能力;细胞划痕法观察内皮细胞的迁移能力;内皮细胞小管形成能力观察内皮细胞的血管生成能力。结果:1VEGF刺激内皮细胞不同时间(0h、6h、12h、24h),VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平呈时间依赖性逐渐增高,12小时达高峰(p<0.05),24小时仍在较高水平。cck8法检测细胞增殖活力,od值在12小时达高峰(p<0.05)。细胞划痕法观察内皮细胞迁移能力;内皮细胞小管形成实验观察内皮细胞管状形成能力;结果显示VEGF促进内皮细胞迁移,促进血管新生。以上结果表明,VEGF可促进人子宫内膜微血管内皮细胞增殖、迁移,进而促进血管新生。VEGF刺激内皮细胞不同短时间点(0min、15min、30min、60min),westernblot法检测mapk信号通路,结果显示:p-erk蛋白在15min时表达最高(p<0.05);p-jnk和p-p38蛋白在30min时表达最高(p<0.05)。说明VEGF可激活mapk信号通路。2westernblot和实时定量pcr分析结果显示,与对照组比较,VEGF组、补肾组、疏肝组的VEGF和VEGFr-2表达均升高(p<0.05);与VEGF组比较,补肾组、疏肝组的VEGF和VEGFr-2表达升高(p<0.05);补肾组与疏肝组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。说明补肾法和疏肝法可促进VEGF和VEGFr-2的表达。3传代内皮细胞,低血清培养24h后,分别给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,再给予VEGF(40ng/ml)刺激内皮细胞,分组具体为:对照组、VEGF组、补肾组、补肾+VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组。结果显示:与对照组比较,VEGF组、补肾组、补肾+VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组的pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平均升高(p<0.05),补肾+VEGF组pcna、cyclind1表达最高(p<0.05),疏肝+VEGF组mmp9表达最高(p<0.05);补肾+VEGF组均高于补肾组(p<0.05),疏肝+VEGF组均高于疏肝组(p<0.05)。两法比较,pcna的mrna及蛋白表达,补肾组优于疏肝组(p<0.05);mmp9的mrna及蛋白表达,疏肝组优于补肾组(p<0.05);cyclind1的mrna及蛋白表达,两法比较无差异(p>0.05)。cck8结果显示VEGF组、补肾组、补肾+VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组的od值均升高(p<0.05);与VEGF组比较,补肾组、补肾+VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组的od值均升高(p<0.05),补肾法及疏肝法均与VEGF具有交互作用(p<0.05)。细胞划痕法和内皮细胞小管形成实验结果显示,补肾法和疏肝法均可增加内皮细胞的迁移能力,促进内皮细胞管状形成,且补肾+VEGF组和疏肝+VEGF组的内皮细胞迁移能力及管状形成能力最显著。以上结果表明,补肾法和疏肝法通过促进pcna、cyclind1、mmp9的表达增加内皮细胞的增殖迁移能力,补肾法促进pcna的表达优于疏肝法,疏肝法促进mmp9的表达优于补肾法。4补肾法和疏肝法通过激活不同信号通路促进内皮细胞增殖、迁移。4.1补肾法通过mapk信号通路促进内皮细胞增殖、迁移。Westernblot结果显示:与对照组比较,VEGF组、补肾组、补肾+VEGF组的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表达均升高(p<0.05);提示补肾法可激活mapk信号通路。分别给予erk信号通路抑制剂pd98059,jnk信号通路抑制剂sp600125,p38信号通路抑制剂sb203580孵育后,进行westernblot分析,结果显示:与补肾组相比,补肾+pd98059+VEGF组的pcna和cyclind1的蛋白表达降低(p<0.05);补肾+sp600125+VEGF组,补肾+sb203580+VEGF组的cyclind1及mmp9的蛋白表达均降低(p<0.05);提示补肾法通过激活erk信号通路促进pcna蛋白表达,通过激活erk,jnk,p38信号通路促进cyclind1蛋白表达,通过激活jnk、p38信号通路促进mmp9蛋白表达。4.2疏肝法通过jnk和p38信号通路促进内皮细胞增殖、迁移。Westernblot结果显示:与对照组比较,VEGF组、疏肝组、疏肝+VEGF组的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表达均升高(p<0.05);提示疏肝法可激活mapk信号通路。分别给予erk信号通路抑制剂pd98059,jnk信号通路抑制剂sp600125,p38信号通路抑制剂sb203580孵育后,进行westernblot分析,结果显示:与疏肝组相比,疏肝+sp600125+VEGF组的cyclind1蛋白表达降低(p<0.05);疏肝+sb203580+VEGF组的pcna、cyclind1及mmp9的蛋白表达均降低(p<0.05),以上结果说明,疏肝法通过激活jnk,p38信号通路促进cyclind1蛋白表达,通过激活p38信号通路促进pcna和mmp9蛋白表达。结论:1VEGF及VEGFr-2是位于mapk信号通路的上游始动因子,能够激活mapk(erk、jnk、p38)信号通路,上调增殖、迁移指标pcna、cyclind1、mmp9的表达,促进子宫内膜血管新生,进而改善子宫内膜容受性。2补肾法及疏肝法均能上调子宫内膜血管VEGF及VEGFr-2的表达,从而促进子宫内膜血管新生,改善子宫内膜容受性。3补肾法与疏肝法通过提高子宫内膜微血管内皮细胞pcna、cyclind1、mmp9的蛋白及mrna表达,促进内皮细胞的增殖与迁移。补肾法提高PCNA的表达作用比疏肝法更显著;疏肝法提高MMP9的表达作用比补肾法更显著。提示补肾法在促进细胞增殖能力上优于疏肝法,而在细胞迁移方面则疏肝法优于补肾法。补肾法及疏肝法均和VEGF具有协同作用,联合应用促进子宫内膜血管新生的作用更强。4补肾法与疏肝法均可以激活子宫内膜血管MAPK信号通路家族中的ERK、JNK、P38 MAPK信号通路。其机制可能是通过激活VEGF与其受体VEGFR-2相结合,进而募集MAPK信号通路的ERK、JNK、P38,使其发生磷酸化而活化,进一步调控信号转导。5补肾法和疏肝法可以多通路促进子宫内膜微血管内皮细胞的增殖迁移,最终促进子宫内膜血管新生。补肾法通过激活ERK信号通路促进PCNA表达,激活ERK、JNK、P38信号通路促进CyclinD1表达,激活JNK、P38信号通路促进MMP9的表达;疏肝法通过P38信号通路促进PCNA和MMP9的表达,通过JNK、P38促进CyclinD1表达。