作为绒肉兼用型山羊,内蒙古绒山羊所产羊绒因其羊绒纤维(Cashmere)轻柔、纤细、柔软、保暖性好、光泽鲜亮等特点而被誉为“软黄金”和“纤维宝石”,在绒毛产业中具有重要的经济价值。内蒙古绒山羊羊绒生长具有明显的周期性变化,分为:休止期、生长期、退行期。目前已有大量的研究表明羊绒的产量和质量受次级毛囊调控,而毛囊内部具有多种类型的毛囊干细胞,其中起主要作用的为毛乳头细胞、毛芽细胞和隆凸区细胞,这些干细胞在不同时期分化或者凋亡,并相互作用、相互联系、相互影响从而推动绒山羊次级毛囊的周期演变。因此,阐明这些干细胞的作用机制有助于对毛囊及绒毛周期更深一步的理解,为提高绒毛的经济效益奠定基础。本研究基于已有的绒山羊研究结果,利用成年内蒙古绒山羊(阿尔巴斯型)个体,获取并分离皮肤毛囊细胞,通过单细胞转录组测序、组织形态学、蛋白质组学以及多色免疫荧光等分别在个体组织、细胞、转录本及蛋白质水平对内蒙古绒山羊不同时期的表达特点进行深入研究,最终获得以下主要结论:1.通过tSNE聚类分析从内蒙古绒山羊皮肤毛囊中鉴定出18个细胞簇,7种细胞类型和13个细胞状态,并描述了不同状态下细胞的关键基因和基因表达谱。其中内皮细胞、黑素细胞、毛芽细胞以及毛母质细胞只有一个细胞状态,真皮细胞有两个中间状态细胞,毛乳头细胞有四个中间状态细胞及隆凸区细胞有七个中间状态细胞,包括内外根鞘细胞。这些细胞在毛囊中相互作用,共同促进了毛囊的再生、萎缩及绒毛的生长脱落,进而推动了绒毛周期的演变。并且在拟时间分化轨迹上细胞分化先后顺序为:真皮细胞、内皮细胞、黑素细胞、毛乳头细胞、毛芽细胞、隆凸区细胞和毛母质细胞。2.通过分群标记发现了主要细胞类型新的标记基因,其中具有代表性的为:Col1a1和Lum高度表达的上皮细胞簇,Pecam1和Aqp1高度表达的内皮细胞簇,Plp1和Sox6高度表达的黑素细胞簇,Lef1和Msx1高度表达的毛乳头细胞簇,Fcgbp和P-cad高度表达的毛芽细胞簇,Sox9和Krt15高度表达的隆凸区细胞簇,Lrat和Gata3高度表达的毛母质细胞簇,Fcer1g和Laptm5高度表达的免疫细胞簇。3.结合光照长度、组织形态学和scRNA基因表达模式聚类结果发现,在生长期当光照时间达到一定阈值,黑素细胞高表达lmcd1,Fabp7,Iga6,Zfp36,Id4,Ramp1,Cryab和Hspe1,受体络氨酸激酶信号通路被激活,进而Gpc1,Gsk3b,Igfbp5,Irs1,Itgav,Stmn1,Nck1,Pak2,Pik3cb,Porr2d,Porr2h,Itsn1,Tiam1,Nrp2,Actr3,Wasf2,Stam2,Cnksr1,Nckap1,Cyfip1和Ptpn18基因表达量升高进一步激活WNT,MAPK等信号通路(细胞命运1),即随着日光长度的增加,黑素细胞中的基因表达达到阈值进而启动毛囊周期,在退行期和休止期黑素细胞的表达同样起到引导作用,在细胞命运2中随着日光强度的减少,黑色素的表达下降到另一个阈值,毛囊周期进入退行期。当日光长度进一步减少时,黑素细胞表达降低到最低水平,毛囊周期进入休止期。由此本研究推测黑素细胞或是体内绒毛周期转变的诱导因素。4.真皮细胞具有两个中间状态细胞,一是富集到PID-AP1/IL67/ATF2/Fox途径,凋亡信号传导途径的调节,细胞分化的负调节,节律性进程等信号途径,其高表达基因有Col1a1,Cd34,Fgf7,Jund和Tmem59并且表达呈下降趋势,揭示了其在休止期毛囊凋亡的重要作用,另一个则富集到受体酪氨酸激酶信号传导,Wnt信号传导途径,MAPK信号传导途径,BMP信号传导途径及间充质细胞分化,脂肪细胞分化,成骨细胞分化等功能,高表达并且表达呈上升趋势的基因有Ddx5,Rpl7,Zfp36l1,Eif4a2,Id1,Igf2。并且多色免疫荧光结果显示真皮细胞在成熟的毛囊中主要位于毛乳头和毛干的上部,而在新新生毛囊中,它们被标记在整个毛囊中所有位置,进一步揭示了真皮细胞在毛囊周期转化中的重要功能。5.通过构建毛乳头细胞谱系分化轨迹,揭示了决定毛乳头细胞命运的关键基因,信号和功能。结果表明,毛乳头细胞在不同周期分化为四个中间细胞状态:中间细胞10在羊绒的生长和维持中显示出重要的功能高表达基因有Sfn,Krt10,Krt14,Tgm3,Krtap3-1,Cnfn,Ivl等;中间细胞1作用于细胞凋亡和羊绒脱落,主要富集了 foxo信号通路,p53信号通路等;中间细胞0启动了新的毛囊周期,维持毛囊迁移并促进羊绒的产生,主要信号通路有wnt信号通路,notch信号通路,mapk信号通路等;其中中间细胞15被认为是DP祖细胞。此外,在中间细胞1的基因表达谱中发现了占比高达84%的假基因,经过分析发现多为核糖体相关假基因,并且其在凋亡过程中起到了重要作用,这一结论促进了假基因的竞争性内源RNA(ceRNA)学说。6.在细胞命运1中,毛芽细胞接受黑素细胞传递的MAPK信号通路和DP细胞传递的Notch信号通路激活刺猬信号“on”状态,然后启动Smad基因家族,TGF-β基因家族,并进一步激活Wnt信号通路,Notch信号通路和MAPK信号通路。并且高表达了 Hmgn1,Cap1,Nop58,Rab25,Hspe1,Srsf10,Tfg,Stag1,Sp3 和Mtx2基因,从表达模式上看,毛芽细胞更像是作为信号的启动器和放大器,启动毛囊的周期,并将信号级联放大传递给隆凸区的细胞,进一步促进毛囊发育和羊绒的生长。并且在实现其功能后很快进入凋亡程序,在细胞命运2中富集到了细胞凋亡过程,细胞死亡的调节,程序性细胞死亡的调节。7.隆凸区细胞更像是高阈值反应细胞,在生长期前期基因表达并没有发生显著的变化,当毛芽细胞基因表达上升并激活相关信号通路并级联放大传递给隆凸区细胞后,在隆凸区细胞中产生了 CTGF/Hcs24-肌动蛋白(β/γ)复合物,CD98-LAT2-ITGB1 复合物,ITGA6-ITGB1-CD151 复合物,ITGA6-ITGB1-CYR61复合物,ETS2-FOS-JUN复合物和FZD5-LGR5-LRP6复合物并高表达了 Achy,Atf4,Cdk4,Egr 1/2/3,Hspa5,Id 1/3/4,Jun,Mdk,Nfil3,Ntrk2,Ptn,Robo2,Slit3,Tgfb3,Klf10,Bhlhe40,Adamts1,Cbx3和Crtc1基因,进而实现了细胞分化,发育,形态变化,增殖和毛囊结构形成。在细胞命运2中,隆凸区细胞信号通路主要富集在β-catenin破坏复合物的分解,β-catenin独立的WNT信号传导,BMP信号的负调控途径和外在凋亡信号传导途径,干细胞之间的细胞间通讯,细胞分化,揭示了隆凸区细胞向根鞘细胞分化的分支,被提取到的相关基因有:Krt19,Abhd12,Ier5,Lypd3,Dsc1,Jag1。Mgp,Npdc1,Gypc,Rnd1,Sbsn 和 Ube2s。8.关于毛母质细胞起源问题有两个方向,其一是基质细胞起源的假说(毛囊预定假说),认为毛母质细胞由休止期后期的毛芽细胞在凋亡过程中遗留的未凋亡的细胞分支分化而来,另一个认为毛母质细胞是由生长期前期的隆凸区细胞接收到毛芽细胞信号后分化而来,在毛母质细胞的基因表达谱和信号通路富集中,虽然PID ECADHERIN NASCENT AJ途径被富集到,而P-cad是毛芽细胞的标记基因,但更多被富集到的信号通路和复合物与隆凸区细胞的更相似,所以尽管证据不够充分,但本研究的结果依旧推动了毛母质细胞由隆凸区细胞分化而来的假说。9.通过拟时间分化轨迹,细胞富集的信号通路及其基因表达谱,结合多色免疫荧光结果,本研究总结了不同细胞在不同时期信号传递的先后顺序:黑素细胞在光照长度达到一定阈值后启动毛囊周期信号,这标志着毛囊周期的启动,随后将信号传递给真皮细胞和毛乳头细胞,毛乳头细胞结合黑素细胞将信号传递到毛芽细胞,毛芽细胞启动并级联放大信号后传递给隆凸区细胞,之后隆凸区细胞分化为根鞘细胞和毛母质细胞,在休止期前期,随着根鞘细胞和毛母质细胞的凋亡过程,隆凸区细胞也随之凋亡,但凋亡过程不是完全的,其中一个分支分化为毛芽细胞并在下个毛囊周期实现其功能。10.通过蛋白质组学,本研究共检测到1903个蛋白质,其中在休止期检测到1377个蛋白,在生长期检测到687个蛋白,在退行期检测到1344个蛋白。通过可视化蛋白质之间的关系,发现仅在休止期表达的有366个蛋白质,这些蛋白质主要与毛囊细胞凋亡过程相关。仅在生长期表达的蛋白有363个蛋白质,主要与毛囊发育过程相关,只在退行期表达的蛋白有280个,在从休止期到生长期的演变过程中,富集了 20 种高价值蛋白质,包括 DLDH,EF2,KPYM,GRP75,MDHC,TNNT3,FHL等,主要参与了周期启动过程;而从生长期到退行期,富集了 63种蛋白质,包括H4,QCR,CAZA,CH60,CAZA2,MIME,FLNC等,与绒毛生长及维持相关。而从退行期到休止期,共有750个共有蛋白,揭示了退行期和休止期毛囊及绒毛具有同一性变化趋势。11.标记基因在细胞中的表达相对稳定,通过对休止期、生长期、退行期不同干细胞的标记基因进行western blot试验验证不同细胞在各时期的细胞数量的变化情况,结果显示毛乳头细胞、真皮细胞、隆凸区细胞从休止期到生长期演变过程中细胞数量持续增加,揭示了该过程毛囊发育的情况而从生长期到退行期没有这些细胞数量没有显著增加,表明毛囊结构发育完善,并且该结果验证了毛乳头细胞的数量决定了毛发的类型这一结论,而wnt1Ob和β-catenin的表达量在三个时期呈现显著增长趋势,揭示了其不仅在毛囊发育过程中起到关键作用,而且在绒毛的生长和后期维持绒毛贴附表皮中也起到至关重要作用。