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肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%以上，而非小细胞肺癌病例中又以肺腺癌较为常见。据统计，NSCLC患者的总体五年生存率不足20%，即使早期手术的患者，仍面临转移或复发的风险。对NSCLC增殖和转移机制的研究有助于发现新的肿瘤标记物、治疗靶点和预后指标，从而改善NSCLC患者的远期预后。
核心岩藻糖基化（CF）是细胞中最常见的蛋白质糖基化形式之一，它指的是在α-1,6岩藻糖基转移酶（FUT8）的作用下，将岩藻糖以α-1,6形式连接到蛋白质N端聚糖核心最内侧的GlcNAc残基上形成的共价修饰，被既往研究证实是多种与癌症有关的重要蛋白质具备生物学活性所必须的翻译后修饰。FUT8是哺乳动物体内唯一催化核心岩藻糖基化的酶，它在多种恶性肿瘤中表现活跃。然而，FUT8及其介导的核心岩藻糖基化在肿瘤微环境中的作用尚不明确。
癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中最重要的细胞成分，它是一种向肌成纤维细胞发生表型转化的肺成纤维细胞。CAFs具有促进NSCLC增殖和转移的能力。本课题组在既往研究中报道了FUT8介导的核心岩藻糖基化在特发性肺纤维化中参与促进周细胞向肌成纤维细胞、肺上皮细胞向肌成纤维细胞发生表型转化的病理过程。这个转化过程与NSCLC中CAFs的激活过程非常相似。因此我们推断FUT8同样参与了NSCLC中对CAFs的形成及其促癌能力调控，而CAFs促癌能力的变化直接影响了肿瘤微环境中与其共生的NSCLC细胞的增殖和转移能力。
ErbB1又称表皮生长因子受体（EGFR），它与恶性肿瘤增殖关系密切。EGFR蛋白的核心岩藻糖基化修饰是EGFR维持其活性并激活下游信号通路所必须的。EGFR活性及其下游信号通路的异常也见于CAFs中，例如EGFR信号活性与乳腺癌中CAFs的促癌能力有关，而EGFR的一些细胞外配体也被证明与CAFs的促癌能力相关。因此，我们推测FUT8通过调控EGFR的核心岩藻糖基化水平调控了EGFR蛋白的磷酸化活性，从而调控了NSCLC中CAFs的促癌能力。
本课题组先前报道了FUT8介导的核心岩藻糖基化在特发性肺纤维化中发挥参与促进了周细胞向肌成纤维细胞、肺上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化，这个转化过程与NSCLC肿瘤微环境中正常肺成纤维细胞（NLFs）被激活成为CAFs的过程非常相似。在本研究中，我们通过三个部分的实验由浅入深地验证了FUT8在来源于NSCLC肿瘤组织的CAFs中介导EGFR蛋白核心岩藻糖基化修饰，从而调控CAFs的促癌能力这一假说。我们通过分析NSCLC患者的生物信息学数据和病理组织，探讨FUT8在CAFs中的表达水平。我们同时证明了CAFs中FUT8在裸鼠体内促进了侵袭性肿瘤微环境的形成，在这种内环境下NSCLC细胞生长速度更快，侵袭性更强。随后，我们通过条件培养基、Transwell小室以及一种原创的新型非接触共培养装置实现了对体外CAFs与NSCLC细胞相互作用的研究。这些研究检测了CAFs中FUT8表达水平对NSCLC细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭等细胞行为的促进作用。此外，我们通过基因集富集分析（GSEA）探究了CAFs中FUT8基因转录水平对CAFs促癌能力影响的潜在分子机制，并预测了EGFR信号通路与FUT8存在调控关系。最后，我们通过体外实验证实了CAFs中EGFR蛋白及其下游主要信号通路的关键信号分子的磷酸化活性是受到FUT8介导的核心岩藻糖基化调控的，而EGFR信号的活性对CAFs的促癌能力是有促进作用的
本研究观察到：①FUT8在肺癌，尤其是肺腺癌中较正常肺组织过表达。②FUT8过表达现象也在一部分NSCLC患者的肿瘤间质中被观察到。③FUT8在一部分NSCLC的原代CAFs中过表达，并介导了高水平的核心岩藻糖基化。④FUT8在CAFs中的表达促进体内侵袭性肿瘤微环境的形成。⑤FUT8在CAFs中的表达水平对CAFs具备促癌能力是必要的。⑥仅上调正常肺成纤维细胞中的FUT8表达水平无法使其获得与CAFs相当的促癌能力。⑦CAFs中的ErbB酪氨酸激酶受体家族途径、细胞凋亡调控网络、β-alanine代谢通路，以及神经活性配体-受体信号通路四个信号通路的活性与FUT8的转录水平正相关。⑧EGFR蛋白受到FUT8所催化的核心岩藻糖基化修饰。⑨EGFR及其下游信号通路的活性受到FUT8介导的核心岩藻糖基化水平的正向调控，EGFR磷酸化活性对CAFs的促癌能力是必要的。
综上所述，我们得出本研究的结论：FUT8在部分（3/5）肺腺癌CAFs中过表达。在CAFs中FUT8介导的核心岩藻糖基化促进了体内和体外侵袭性肿瘤微环境的形成，在此内环境下NSCLC细胞表现出更强的增殖能力和侵袭性。EGFR信号转导对CAFs的促癌能力具有促进作用，而EGFR磷酸化活性及其下游多个信号通路活性受EGFR蛋白核心岩藻糖基化修饰的调控。
本研究的意义是证明了FUT8介导的核心岩藻糖基化促进了CAFs的促癌能力，并初步解释了其作用机制，发现了FUT8作为研究恶性肿瘤微环境的潜在突破口。此外，我们推测，由于核心岩藻糖基化是许多蛋白质的重要翻译后修饰形式，所以EGFR可能不是唯一在CAFs中被FUT8调控的关键蛋白质。FUT8调控肿瘤微环境的更多机制有待通过进一步研究来挖掘。
核心岩藻糖基化（CF）是细胞中最常见的蛋白质糖基化形式之一，它指的是在α-1,6岩藻糖基转移酶（FUT8）的作用下，将岩藻糖以α-1,6形式连接到蛋白质N端聚糖核心最内侧的GlcNAc残基上形成的共价修饰，被既往研究证实是多种与癌症有关的重要蛋白质具备生物学活性所必须的翻译后修饰。FUT8是哺乳动物体内唯一催化核心岩藻糖基化的酶，它在多种恶性肿瘤中表现活跃。然而，FUT8及其介导的核心岩藻糖基化在肿瘤微环境中的作用尚不明确。
癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中最重要的细胞成分，它是一种向肌成纤维细胞发生表型转化的肺成纤维细胞。CAFs具有促进NSCLC增殖和转移的能力。本课题组在既往研究中报道了FUT8介导的核心岩藻糖基化在特发性肺纤维化中参与促进周细胞向肌成纤维细胞、肺上皮细胞向肌成纤维细胞发生表型转化的病理过程。这个转化过程与NSCLC中CAFs的激活过程非常相似。因此我们推断FUT8同样参与了NSCLC中对CAFs的形成及其促癌能力调控，而CAFs促癌能力的变化直接影响了肿瘤微环境中与其共生的NSCLC细胞的增殖和转移能力。
ErbB1又称表皮生长因子受体（EGFR），它与恶性肿瘤增殖关系密切。EGFR蛋白的核心岩藻糖基化修饰是EGFR维持其活性并激活下游信号通路所必须的。EGFR活性及其下游信号通路的异常也见于CAFs中，例如EGFR信号活性与乳腺癌中CAFs的促癌能力有关，而EGFR的一些细胞外配体也被证明与CAFs的促癌能力相关。因此，我们推测FUT8通过调控EGFR的核心岩藻糖基化水平调控了EGFR蛋白的磷酸化活性，从而调控了NSCLC中CAFs的促癌能力。
本课题组先前报道了FUT8介导的核心岩藻糖基化在特发性肺纤维化中发挥参与促进了周细胞向肌成纤维细胞、肺上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化，这个转化过程与NSCLC肿瘤微环境中正常肺成纤维细胞（NLFs）被激活成为CAFs的过程非常相似。在本研究中，我们通过三个部分的实验由浅入深地验证了FUT8在来源于NSCLC肿瘤组织的CAFs中介导EGFR蛋白核心岩藻糖基化修饰，从而调控CAFs的促癌能力这一假说。我们通过分析NSCLC患者的生物信息学数据和病理组织，探讨FUT8在CAFs中的表达水平。我们同时证明了CAFs中FUT8在裸鼠体内促进了侵袭性肿瘤微环境的形成，在这种内环境下NSCLC细胞生长速度更快，侵袭性更强。随后，我们通过条件培养基、Transwell小室以及一种原创的新型非接触共培养装置实现了对体外CAFs与NSCLC细胞相互作用的研究。这些研究检测了CAFs中FUT8表达水平对NSCLC细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭等细胞行为的促进作用。此外，我们通过基因集富集分析（GSEA）探究了CAFs中FUT8基因转录水平对CAFs促癌能力影响的潜在分子机制，并预测了EGFR信号通路与FUT8存在调控关系。最后，我们通过体外实验证实了CAFs中EGFR蛋白及其下游主要信号通路的关键信号分子的磷酸化活性是受到FUT8介导的核心岩藻糖基化调控的，而EGFR信号的活性对CAFs的促癌能力是有促进作用的
本研究观察到：①FUT8在肺癌，尤其是肺腺癌中较正常肺组织过表达。②FUT8过表达现象也在一部分NSCLC患者的肿瘤间质中被观察到。③FUT8在一部分NSCLC的原代CAFs中过表达，并介导了高水平的核心岩藻糖基化。④FUT8在CAFs中的表达促进体内侵袭性肿瘤微环境的形成。⑤FUT8在CAFs中的表达水平对CAFs具备促癌能力是必要的。⑥仅上调正常肺成纤维细胞中的FUT8表达水平无法使其获得与CAFs相当的促癌能力。⑦CAFs中的ErbB酪氨酸激酶受体家族途径、细胞凋亡调控网络、β-alanine代谢通路，以及神经活性配体-受体信号通路四个信号通路的活性与FUT8的转录水平正相关。⑧EGFR蛋白受到FUT8所催化的核心岩藻糖基化修饰。⑨EGFR及其下游信号通路的活性受到FUT8介导的核心岩藻糖基化水平的正向调控，EGFR磷酸化活性对CAFs的促癌能力是必要的。
综上所述，我们得出本研究的结论：FUT8在部分（3/5）肺腺癌CAFs中过表达。在CAFs中FUT8介导的核心岩藻糖基化促进了体内和体外侵袭性肿瘤微环境的形成，在此内环境下NSCLC细胞表现出更强的增殖能力和侵袭性。EGFR信号转导对CAFs的促癌能力具有促进作用，而EGFR磷酸化活性及其下游多个信号通路活性受EGFR蛋白核心岩藻糖基化修饰的调控。
本研究的意义是证明了FUT8介导的核心岩藻糖基化促进了CAFs的促癌能力，并初步解释了其作用机制，发现了FUT8作为研究恶性肿瘤微环境的潜在突破口。此外，我们推测，由于核心岩藻糖基化是许多蛋白质的重要翻译后修饰形式，所以EGFR可能不是唯一在CAFs中被FUT8调控的关键蛋白质。FUT8调控肿瘤微环境的更多机制有待通过进一步研究来挖掘。