凤丹（Paeomia ostii）为芍药科芍药属植物,其根皮（凤丹皮）为常用的中药材,其种籽可加工牡丹籽油,具有重要的经济价值;已有研究发现凤丹还具有较强的耐铜能力,可作为优良的生态修复植物用于铜污染土壤的修复。目前仅对凤丹耐铜的生理机理有所研究,但对其响应铜胁迫的分子机理研究较少。近年来发现miRNAs（microRNAs）在调控植物对重金属胁迫适应性中发挥着重要作用。而目前对于miRNA在凤丹响应铜胁迫过程中的调控作用尚不清楚。为此,本研究以凤丹幼苗为试材,在水培条件下进行铜胁迫处理,一方面分析铜胁迫下凤丹的生理反应及基因表达的变化,另一方面通过构建对照组和铜胁迫处理组两个cDNA文库,进行miRNAs的高通量测序,通过用生物信息学方法分析鉴定响应铜胁迫差异表达的miRNAs,并预测其靶基因,另外还对重要的miRNAs的时空表达特征进行了分析。本研究可丰富凤丹耐铜分子机理的理论,为将凤丹用于铜污染土壤的生态修复提供科学依据,并为培育耐铜性更强的凤丹品种提供分子育种途径。主要的研究结果如下:1.凤丹响应铜胁迫的生理反应及重要基因的表达变化研究发现在短时间铜处理对凤丹生长无显著不良影响,长时间处理抑制凤丹的正常生长,并造成毒害。凤丹根、茎、叶的MDA、SOD、POD活性变化幅度及响应的敏感性有很大不同,根最敏感,叶片最不敏感,茎介于二者之间,根系是受重金属影响最主要的部位。为了解凤丹响应铜胁迫基因表达的变化,从前人研究结果中挑选与响应铜胁迫相关的12条重要的基因:ABC家族基因,抗氧化酶类基因POD和SOD,ACS家族基因,ETR家族基因以及其他7个与胁迫相关的转录因子:ERF,DREB,CBF,WRKY,MYB N4(C和TGA,采用qRT-PCR对其进行实时定量表达分析,结果表明,多数差异表达的基因表达上调,例如ABC家族基因,POD和SOD基因,ACS家族基因,及胁迫相关转录因子ERF,CBF,WRKY,DREB,MYB及NAC。其中,一些推测与胁迫相关的转录因子在上调趋势明显,例如ERF,CBF,WRKY,DREB,MYB及NAC,在处理组中铜胁迫下差异表达下调有:ETR家族基因和推测与胁迫相关的转录因子TGA。同时,与转录组数据差异表达基因的分析结果趋势一致,验证凤丹转录组测序结果的准确性和可靠性,并可为miRNAs的功能验证提供支持和参考,为进一步探究miRNAs调控凤丹对铜胁迫适应性中发挥着重要作用。2.凤丹2个小RNA文库高通量测定结果建立对照和铜胁迫处理2个小RNA文库并进行高通量测序,最终注释出了 89个家族的102条已知的保守miRNAs,其中一些序列在植物中存在高度保守性;同时基于已有的转录组测序数据,用生物信息学方法鉴定出34个新的miRNAs,并对其靶基因进行预测。通过对照组和铜胁迫处理组文库的比较,发现了差异表达的12个保守miRNAs和18个未知miRNAs。对其中差异表达的miRNAs结合其靶基因,采用qRT-PCR的方法进行表达分析验证,结果表明,与sRNA测序的数据趋势一致,验证了高通量测序的准确性和可靠性,并且符合miRNAs对靶基因的负调控特征,证明了这些差异表达的miRNAs可能在凤丹响应铜胁迫过程中起到重要的调控作用。3.铜胁迫诱导表达的miRNAs的时空表达特征从差异表达的已知和新的miRNAs中选取5个表达差异显著的miRNAs,通过qRT-PCR方法研究凤丹铜处理后Oh,6 h,12 h,24 h时间点的根、茎、叶的miRNA及其靶基因的相对表达量,揭示其时空表达特征。结果表明,铜胁迫下,根、茎、叶中 miRNA902c-3p,novel_miR22,novel_miR27,novel_miR32,novel_miR3 均稳定表达,推测各组织器官均对铜胁迫有抗逆反应。铜胁迫下,3个miRNA（miRNA902-3p、novel_miR₃、novel_miR₂2）在根、茎、叶中均有不同程度的下调:其中miRNA902-3p的在根、茎、叶中的表达量始终保持微有下调,表达量差异不明显;novel_miR₃的表达量处理6 h时达到峰值。另外2个miRNA（novel_miR₂7、novel_miR₃2）的表达量上调:其中novel_miR₂7在根和茎中反应较为敏感,1 h后即有上调表达;novel_miR₃2主要在茎和叶中差异表达,在根系中表达水平低,总体呈上调表达。同时通过qRT-PCR方法研究了上述5个miRNA对应的靶基因响应铜胁迫的表达情况,结果与各自对应的miRNAs的表达趋势正好相反。其中miRNAs表达趋势为下调的 miRNA902-3p 的 靶基因 CL939.Contig8_all,novel_miR₃ 的靶基因CL1240.Contigl_all 以及 novel_miR₂2 靶基因 Unigene26288_All 在根、茎、叶中均表现为上调的趋势。在铜胁迫下,novel_miR₃的靶基因CL1240.Contig1_all主要在根和叶中表达,在茎中表达量极低,受胁迫差异变化不显著。nove1_miR₂2靶基因Unigene26288_All总体呈上调趋势,主要在根和茎中表达,在叶中表达水平低。novel-miR 27 靶基因 CL4800.Contig2_all 和 novel_miR₃2 靶基因 Unigene25888_All在根、茎、叶总体呈下调趋势,下调趋势与miRNA相比略有延迟。以上结果证明了上述miRNA及其靶基因在凤丹响应铜胁迫过程中发挥着重要作用。miRNA及其靶基因在根部差异表达明显,推测凤丹根部是响应铜胁迫最敏感的部位,根部可能通过分泌细胞功能蛋白、丹皮酚类等物质响应铜胁迫。研究结果为揭示凤丹响应铜胁迫的分子机理提供了重要线索。