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清道夫受体,作为一类先天性免疫受体,在宿主先天性防御中起着重要的作用。然而,到目前为止,对猪清道夫受体的研究还非常有限。目的:为了深入了解猪清道夫受体SRA和MARCO的生物学特性,揭示SRA和MARCO在免疫中的作用,本文以猪A类清道夫受体SRA和MARCO为研究对象,利用原核表达系统对受体的胞外区域进行表达,制备纯化的重组蛋白,以重组蛋白为免疫原,制备多抗血清,验证多抗血清的特异性。此外,从临床发病猪的肺部分离细菌,构建猪SRA或MARCO的稳定细胞系,检测SRA和MARCO介导对细菌的吞噬功能,揭示其生物学功能。材料与方法:①猪SRA和MARCO的分子克隆、表达、纯化及其抗体的制备:根据GenBank SRA（NM001243874）和MARCO（JQ25702.1）的全基因序列,设计引物,利用猪肺组织扩增SRA和MARCO编码序列片段,克隆至载体pMD18-T中,测序验证扩增序列的正确性。选取SRA胞外区基因片段（711bp）和MARCO胞外区基因片段（709bp）,利用PCR技术获得目的片段,分别克隆入原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达载体pET-SRA-c和pET-MARCO-c。利用原核表达系统表达重组蛋白rSRA-c（约32kDa）和rMARCO-c（约31kDa）,以亲和层析技术获得纯化的rSRA-c和rMARCO-c。分别利用纯化的rSRA-c和rMARCO-c为免疫原,免疫BALB/c小鼠（100ug/小鼠）,制备多抗血清。②SRA和MARCO的真核表达载体及其稳定细胞系的构建:将编码序列分别克隆入PCDNA3.O载体中,构建真核表达质粒,将真核表达质粒转染至CHO细胞中,通过96孔板细胞传代及G418的药物筛选构建稳定表达猪SRA或MARCO的CHO细胞的细胞系,通过RT-PCR和Western blot对细胞系进行验证。?SRA和MARCO介导对细菌吞噬功能的分析:对临床发病猪进行解剖,并从肺部分离细菌并用FITC进行标记,将标记好的细菌与构建的稳定细胞系相互作用,从而对SRA和MARCO的功能进行分析。结果:①扩增结果显示SRA和MARCO的片段大小分别为1341bp和1188bp,与预期结果一致,测序结果与原编码序列相同,表明扩增的序列正确。原核质粒PCR验证结果显示SRA和MARCO的片段大小分别为711bp和709bp,与目的片段大小一致。测序结果与选择的胞外段序列一致,表明原核表达质粒构建成功。经Western blot分析,SRA和MARCO分别在32kDa和31kD左右处出现了条带,与目的片段大小相同,表明实验中制备的多抗血清可以识别rSRA-c（约32kDa）和rMARCO-c（约31kDa）,具有很好的免疫原性。②真核质粒PCR结果中SRA和MARCO的大小分别为1341bp和1188bp,与编码序列大小一致,测序结果与编码序列相同,表明真核表达质粒构建成功。RT-PCR结果显示SRA细胞系出现了大小为1341bp的条带,与SRA的编码序列大小相同,MARCO细胞系中出现了片段大小为1188bp的条带,与MARCO的编码序列大小相同。细胞系蛋白的Western blot结果显示SRA的阳性克隆细胞蛋白样在55kD处出现了目的条带,MARCO的阳性克隆细胞蛋白样在小于55kD处出现了目的条带,表明稳定细胞系构建成功。③从临床发病猪的肺中分离获得了胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及化脓链球菌。经对猪SRA和MARCO介导对细菌吞噬功能的分析,表明猪SRA和MARCO都能有效地介导对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及化脓链球菌的吞噬,但都不能介导对胸膜肺炎放线杆菌的吞噬,说明猪SRA和MARCO能够介导对部分细菌的吞噬。本研究不仅为进一步研究猪SRA和MARCO在病原微生物感染中的作用做好铺垫,而且为揭示猪SRA和MARCO在病原菌中的作用奠定基础。