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甲状旁腺功能减退是指具有生物活性的甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)分泌不足,或者不能使靶器官产生生理效应,其特点是血钙降低,血磷增高,血中PTH减少或测不出,并表现出神经肌肉兴奋性增加的临床症状。多数甲状旁腺功能减退为继发性,主要发生在甲状腺或甲状旁腺手术后,由于术中误伤或切除甲状旁腺所致。甲状旁腺功能减退的临床症状主要取决于血钙降低的程度与持续时间及下降的速度。主要的临床表现包括指端或嘴周麻木或刺痛,手足与面部肌肉痉挛,继之出现手足搐搦(血清钙一般在2mmol/L以下),有些患者可出现癫痫样神经症状,严重降低患者的生活质量。本课题通过基因工程方法制备表达PTH的脂肪间充质干细胞,观察其对甲状旁腺功能减退的治疗作用,探索细胞治疗甲状旁腺功能减退的新途径。一、大鼠甲状旁腺功能减退模型的建立目的:建立SD大鼠甲状旁腺功能减退的模型。方法:应用纳米炭负显影技术于术中显示甲状旁腺,行甲状旁腺切除术,切除标本行光学相干断层扫描(OCT)及病理染色,记录术后一般情况改变,评估血清钙及PTH变化情况。结果:纳米炭负显影可于术中清楚辨认甲状旁腺,切除组织经OCT成像及病理染色分析证实为甲状旁腺组织。术后第1,5,10天,实验组血钙分别为1.79±0.09,1.63±0.07,1.61±0.13 mmol/L,血PTH水平分别为13.16±3.02,15.24±4.46,15.91±5.76 ng/L,均显著低于对照组(P<0.05)。二、基因工程方法制备表达PTH的间充质干细胞的研究目的:构建突变型PTH慢病毒载体,用纯化浓缩后的慢病毒颗粒感染大鼠间充质干细胞(MSCs),从而获得表达PTH的MSCs。方法:用DNA聚合酶将前甲状旁腺激素原(prepro PTH)基因连接入慢病毒载体质粒,PCR定点突变法突变出Furin酶切位点,载体构建成功后转染293T细胞,收获慢病毒颗粒并进行纯化、浓缩;采用Ⅰ型胶原酶消化大鼠脂肪组织,获得大鼠脂肪间充质干细胞(ASCs),定向诱导分化鉴定;用慢病毒对大鼠MSCs进行转导,检测感染后MSCs培养上清液中PTH的表达量。结果:成功从脂肪组织中分离培养出间充质干细胞;表达PTH的慢病毒经浓缩后,滴度达到2.5×107TU/ml,可以成功感染间充质干细胞,感染后上清中PTH浓度达到44.09±2.33 pg/ml。三、间充质干细胞基因治疗甲状旁腺功能减退的实验研究目的:观察表达PTH的间充质干细胞对大鼠甲状旁腺功能减退的治疗作用。方法:运用纳米炭辅助建立大鼠甲状旁腺功能减退模型,术后立即给予皮下注射表达PTH的间充质干细胞(PTH-MSCs),并与注射未经修饰的间充质干细胞(MSCs)及注射生理盐水(NS)的大鼠进行比较;观察不同组大鼠一般情况变化及生存率改变;检测三组大鼠术后血钙及血PTH变化情况;采用RT-PCR法检测术后m PTH基因体内表达情况。结果:PTH-MSCs治疗组大鼠术后精神良好,无大鼠出现抽搐现象,术后5 d、10 d血钙分别为2.05±0.07,2.01±0.20 mmol/L,血PTH分别为23.30±5.11,25.41±6.86 ng/L,均显著高于MSCs组和NS组(P<0.05),至术后30天内只有一只大鼠死亡;MSCs组及NS组大鼠术后精神萎靡,分别有4例(4/6)和3例(3/6)出现抽搐,在观察期内全部死亡。结论:将人prepro-PTH基因信号肽突变出Furin蛋白酶酶切位点,可实现有活性的PTH在间充质干细胞的表达;纳米炭混悬液可于术中辅助识别甲状旁腺,并用于建立大鼠甲状旁腺功能减退模型;表达PTH的大鼠间充质干细胞皮下移植对甲状旁腺功能减退有治疗作用,可能成为甲状旁腺功能减退传统疗法外的一个新的治疗途径。