牡丹（Paeonia suffruticosa）是我国的传统名花,也是著名的观赏与药用植物。本课题组在牡丹组织培养,体细胞胚发生过程中发现非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化困难,同时存在胚性细胞与非胚性细胞共存的现共。因此,提高非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化率已成为建立牡丹体胚再生体系中亟待解决的问题。目前研究认为体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK）基因在植物愈伤组织诱导中起重要作用,能显著提高植物的胚性愈伤组织发生率,可以作为植物胚性愈伤组织发生早期的分子标记之一。本研究在课题组前期工作的基础上,以牡丹品种‘凤丹白’试管苗叶柄诱导形成的愈伤组织为材料,首先优化了牡丹愈伤组织遗传转化体系,利用CRISPR/Cas9系统构建了PsSERK干扰表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化体系分别将PsSERK基因过量表达载体和干扰表达载体转入牡丹愈伤组织中,测定了相关激素、酶活指标,并采用实时荧光定量PCR技术对不同载体的PsSERK表达情况进行了分析,为探究PsSERK基因在牡丹体胚发生过程中的调控机理及其功能提供依据。主要研究及结果如下:1.农杆菌介导的牡丹遗传转化体系的优化在对牡丹愈伤组织进行转基因预实验时,试验不同浓度的抑菌剂（Cef、Cb）的除菌效果,并对生长状况进行统计。结果发现,在农杆菌介导的牡丹愈伤组织遗传转化体系中,对农杆菌LBA4404除菌效果较好的是Cb,且适宜浓度为200 mg·L^-1。2.PsSERK干扰表达载体的构建根据PsSERK基因编码区全长cDNA序列,设计靶点,靶点通过Bbs I位点克隆到psgR-Cas9-At载体骨架中,形成中间克隆载体PsSERK-psgR-Cas9-At,分析psgR-Cas9-At和pCAMBIA1300的酶切位点,通过Hind III、Kpn I酶切位点进行双酶切,连接,形成重组质粒。成功构建PsSERK干扰表达载体pCAMBIA1300-PsSERK-psgR-Cas9-At。采用冻融法将构建好的干扰表达载体转入农杆菌LBA4404中。3.农杆菌介导的牡丹愈伤组织遗传转化利用优化的农杆菌介导的遗传转化方法,分别将PsSERK过表达载体和干扰表达载体转入牡丹愈伤组织中。采用GUS基因组织化学染色法进行,试验结果成功检测到GUS瞬时表达活性,愈伤组织碎块呈蓝色,初步表明PsSERK过量表达载体转入牡丹愈伤组织中。以转基因牡丹愈伤组织cDNA为模板做PCR扩增得到与预期大小一致的条带,而阴性对照没有条带,初步表明PsSERK干扰表达载体成功转入牡丹愈伤组织中。4.PsSERK基因功能的初步分析首先分别将PsSERK基因过表达和干扰表达载体转入牡丹愈伤组织,以添加外源细胞分裂素类物质6-BA(0.5 mg·L^-1)、TDZ(0.1 mg·L^-1)的未转基因愈伤组织（对照）为研究对共,分别在0,5,10,15,20,25,30,35,40,45 d采集上述三处理的愈伤组织,进行相关的激素（ABA、GA₃、IAA）,酶活性（POD、SOD、APX、CAT）等指标的测定以及实时荧光定量,试验结果表明,三种处理的牡丹愈伤组织的PsSERK基因表达量由高到低排序依次是:过量>未转基因（对照）>干扰,且均在30 d达到最高值。PsSERK基因在牡丹体胚发生过程中的酶代谢和激素表达上都有重要作用,推测在培养的20-25 d可能开始出现胚性细胞,25-35d可能出现大量胚性细胞。同时将PsSERK干扰表达载体转入模式植物拟南芥,结果表明,PsSERK基因干扰表达使得拟南芥根系发育不良,短小,植株表现出生长缓慢,开花延迟特征,对拟南芥的生长和花期有很大影响。