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目的:脑卒中是全球人类死亡和残疾的主要原因之一,缺血性脑卒中是其最常见的一种类型。目前,针对缺血性脑卒中有效的治疗方法是静脉溶栓和机械取栓,但是这两种方法的应用范围都受限于其短暂的时间窗。与之不同的是,缺血性脑损伤后的神经修复过程可以维持数月,这大大延长了缺血性脑卒中的治疗时间窗。这种神经系统出于自我保护,为了应对损伤而在结构和功能上进行自我调整的能力,被称为“神经可塑性”。具体来说,神经发生、轴突再生以及新突触连接的建立等都是神经可塑性的重要组成部分。更重要的是,神经可塑性与脑缺血后的功能恢复息息相关。寻找到脑缺血诱导的神经可塑性的控制机制对改善卒中预后至关重要。C-C趋化因子受体5（C-C chemokine receptor 5,CCR5）是七次跨膜G蛋白偶联受体超家族的成员之一。已被证实是一种可塑性和学习记忆的抑制因子。在实验中人为地抑制CCR5能够促进缺血性脑卒中后的运动恢复。此外,患有自然发生的CCR5-delta 32功能缺失突变的患者在脑缺血后的运动恢复也会增强。这表明抑制CCR5会对缺血性脑卒中的预后恢复产生积极良好的影响。然而,在缺血性脑卒中的病理条件下,CCR5究竟能改变神经可塑性的哪些方面,又是通过何种途径影响神经可塑性的,还需要进一步的探索。研究表明,成熟的中枢神经系统再生能力有限,很大一部分原因是允许条件的内在下降。然而,缺血性脑卒中后修复失败的机制仍然存在很多空白。中枢神经系统的再生需要耗费大量能量,众所周知葡萄糖是大脑生命活动的主要能量来源,糖酵解可以在短时间内提供足够多的能量,因此在大脑的能量供应体系中发挥着不可或缺的作用。此外,糖酵解过程中产生的多种代谢中间体有可能为后续的神经修复提供必要的原材料。研究人员发现,在能量压力条件下,突触的能量需求会通过糖酵解代谢产物的组装在局部得到满足,以维持突触功能和行为。在阿尔兹海默病中,糖酵解的增强已被证实能促进神经元轴突和树突的生长。综上,我们将在动物和细胞两个层面,应用CRISPR/Cas9系统构建CCR5敲除的大鼠模型或应用马拉维罗抑制CCR5受体,来探索CCR5对缺血性脑卒中后神经功能恢复的影响,并进一步发掘CCR5-糖酵解-神经可塑性三者之间的内在联系。研究方法:1、在本实验中,我们首先将SD大鼠分为假手术组（Sham组）和接受大脑中动脉闭塞手术的缺血性脑卒中组（Stroke组）,RT-q PCR检测梗死周围皮层中CCR5表达量的变化;并利用免疫荧光双染技术定位CCR5主要表达在何种细胞上。2、随后利用CRISPR/Cas9系统,在SD大鼠的背景下,构建CCR5敲除（knockout,KO）的大鼠模型,并将实验组分为以下4组:野生型假手术组（Sham WT组）,CCR5敲除鼠假手术组（Sham KO组）,野生型缺血性脑卒中组（Stroke WT组）和CCR5敲除鼠缺血性脑卒中组（Stroke KO组）。通过观察各组大鼠在圆筒实验和梯形平衡木行走实验中的行为学表现来评估其神经功能恢复情况。3、利用免疫荧光和Western Blot实验检测各组大鼠的轴突可塑性和突触可塑性情况。4、为了探索具体的分子机制,我们采用氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）体外模型来模拟缺血性脑卒中,使用FDA批准的CCR5拮抗剂马拉维罗（Maraviroc,MVC）来抑制CCR5。将神经细胞分为以下3组:对照组（Control组）,氧糖剥夺/复氧组（OGD/R组）和氧糖剥夺/复氧+MVC干预组（OGD/R+MVC组）。RT-q PCR实验检测OGD/R后CCR5的表达量变化。通过将三组细胞进行蛋白组学测序,并对测序所得结果进行进一步的GSEA富集分析,筛选出CCR5被抑制后变化较为显著的通路。5、在体外试验中,同样将细胞分为Control组、OGD/R组和OGD/R+MVC组,采用Western Blot实验或使用相关检测试剂盒,对多种蛋白激酶,环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）及其磷酸化状态p CREB,葡萄糖转运蛋白,糖酵解关键酶和糖酵解相关产物等的表达水平进行检测,来验证糖酵解通路在CCR5调控神经可塑性中所发挥的作用。6、最后,在体内实验中,对Sham WT组,Sham KO组,Stroke WT组和Stroke KO组的梗死周围皮层中的蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）,CREB及其磷酸化状态p CREB,葡萄糖转运体3（Glucose transporter 3,Glut3）,己糖激酶1（Hexokinase,HK1）,丙酮酸激酶（Pyruvate kinase,PKM）和乳酸含量进行再一次的验证。以求更全面地证实糖酵解通路在CCR5调控神经可塑性中的重要作用。结果:1、RT-qPCR的结果显示,梗死周围皮层中CCR5表达显著上升;且免疫荧光图像显示CCR5主要与Neu N+的神经元共定位。2、在大鼠行为学测试实验中,与Stroke WT组相比,Stroke KO组大鼠的神经功能恢复更为出色。具体体现在双上肢的使用频率更为频繁,自主运动增多;以及平衡木行走实验中前肢和后肢的脚步错误率均更低。提示敲除CCR5可在一定程度上改善缺血性脑卒中的预后。3、免疫荧光和Western Blot的实验结果显示,对CCR5的敲除显著增强了缺血性脑卒中后的轴突可塑性和突触可塑性。使得CCR5-神经可塑性-运动功能三者之间的联系更为紧密。4、在体外实验中,RT-q PCR实验显示,OGD/R后CCR5的表达量升高明显。蛋白组学测序及后续的GSEA富集分析结果显示,抑制CCR5后,糖酵解相关通路上调显著。结合已有研究表明增强的糖酵解能够促进神经可塑性,我们将下一步研究的目标瞄准糖酵解。5、在体外实验的验证中,MVC的干预使得CCR5的下游分子PKA的表达显著升高,但是Akt和PKC的表达没有差异。PKA表达量的升高激活了CREB,进而影响了一系列糖酵解相关蛋白的表达。主要包括Glut3和HK1;PKM的表达虽有上升趋势,但是没有统计学差异;HK2的表达没有变化。此外,糖酵解的产物乳酸含量也在应用MVC后升高。上述结果提示抑制CCR5可能会通过活化PKA/CREB通路促进糖酵解过程。6、在体外实验获得的结果的基础之上,我们在体内实验中,再次验证了敲除CCR5能够激活PKA/CREB通路,进而增强糖酵解过程。结合上述实验结果,我们在缺血性脑卒中的背景下,描绘出“CCR5-PKA-CREB-糖酵解-神经可塑性-运动功能”这一完整途径。结论:1、缺血性脑卒中后梗死周围皮层中CCR5表达量升高,且增加的CCR5主要与Neu N+的神经元共定位。在缺血性脑卒中的手术背景下,CCR5 KO大鼠的运动功能恢复要优于WT大鼠。更重要的是,CCR5 KO大鼠的神经可塑性也强于WT大鼠,这可能是其神经功能恢复良好的原因之一。2、在体外实验中使用OGD/R模拟缺血性脑卒中,发现OGD/R后CCR5表达量升高,这与第一部分体内的结果一致。蛋白组学测序结果提示,抑制CCR5后神经可塑性增加的原因可能是糖酵解过程的增强。3、体外实验证实抑制CCR5可激活PKA/CREB通路,进而上调其下游的糖酵解相关蛋白（Glut3、HK1和PKM）,促进糖酵解过程,增强神经可塑性。在体内实验中,“CCR5-PKA-CREB-糖酵解-神经可塑性-运动功能”这一通路再次得到验证。