背景:大量的研究证明,新陈代谢紊乱与恶性肿瘤关系密切。作为一个主要的代谢器官,肝脏在维持葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸的复杂的动态平衡过程中起着关键的作用。目前,人们已经意识到特定蛋白功能的异常变化是肿瘤发生发展和获得恶性生物学表型的始动因素。蛋白质的功能一方面与其表达含量密切相关,同时更依赖于自身活性的变化,而蛋白质的翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)是调节其功能活性的主要方式。O-GlcNAcylation糖基化,作为一种被广泛研究的蛋白翻译后修饰的方式,也被多次报道涉及到多种癌症的进程。O-GlcNAcylation糖基化由O-连接-N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT,O-linked N-acetylglucosamine transferase)催化完成。OGT的主要功能是将尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)上的N-乙酰葡糖胺基团转移到目标蛋白质上。而反向的过程则由MGEA5基因编码的N-乙酰葡糖胺糖苷酶(OGA,N-acetyl-β-glucosaminidase)完成。这两种酶共同动态的根据细胞内信号对O-GlcNAcylation糖基化及相应蛋白质的功能做出调节。目前已有研究表明O-GlcNAcylation糖基化在非酒精性脂肪性肝病相关的肝细胞癌(NAFLD-HCC)及高糖刺激诱发肝癌发生发展的过程中发挥着重要的作用。肝细胞中的YAP蛋白可被O-GlcNAcylation糖基化修饰,并且在高糖刺激的肝癌发生过程中具有重要作用。然而由于O-GlcNAcylation糖基化修饰的广泛性,我们认为其在肝癌中可能还存在其他调控靶蛋白,组成更为复杂的调控网络,对肝癌的恶性表型产生深远的影响。所以继续研究O-GlcNAcylation糖基化修饰在肝癌中的作用,阐述其调控机制仍具有重要意义。目的:本研究的目的是探讨O-GlcNAcylation糖基化在肝癌恶性表型中的作用,并找出可能的潜在作用机制。1.观察研究O-GlcNAcylation糖基化水平在肝癌组织、细胞及正常肝组织、细胞中的表达差异。2.通过体内外实验观察O-GlcNAcylation对肝癌增殖转移表型的调控作用。3.探索O-GlcNAcylation调控肝癌增殖转移的潜在分子机制。方法:1.通过免疫组织化学染色的方法对于肝癌及癌旁组织进行检测,分析O-GlcNAcylation糖基化水平在肝癌组织与正常组织中的表达变化,并通过Kaplan-meier生存曲线分析O-GlcNAcylation糖基化水平对于患者预后的影响。2.通过western blot实验检测O-GlcNAcylation糖基化水平及其修饰酶OGT在肝癌细胞系及正常肝细胞系中的变化,在细胞学水平上证实其差异。3.O-GlcNAcylation糖基化水平对肝癌细胞增殖能力的影响通过CCK8,BrdU和平板克隆实验等体外实验进行研究,同时利用裸鼠皮下荷瘤模型观察O-GlcNAcylation糖基化在体内对移植瘤生长的影响。4.通过Transwell迁移实验,划痕实验,3D侵袭实验及高内涵实验观察O-GlcNAcylation糖基化对肝癌转移能力的可能作用。5.利用质谱分析方法分析肝癌中可能被O-GlcNAcylation糖基化修饰的相关蛋白,对质谱结果进行生物信息学分析,找出潜在可能的靶蛋白。6.通过网络数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)预测靶蛋白糖基化位点,并通过改变细胞糖基化水平来观察靶蛋白随之发生的变化,最后运用co-IP的方式来确定靶蛋白与O-GlcNAcylation糖基化修饰酶OGT的直接作用。7.运用siRNA的方法,在OGT过表达的细胞系里干扰靶蛋白水平,观察其下调是否可以逆转O-GlcNAcylation糖基化水平升高带来的作用。结果:1.免疫组织化学染色结果显示,O-GlcNAcylation糖基化水平在肝癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,并且Kaplan-meier生存曲线显示O-GlcNAcylation糖基化水平的升高预示着较差的预后水平。在随后对调控O-GlcNAcylation糖基化水平的关键酶OGT的检测中。我们发现OGT在肝癌组织中表达也要明显高于癌旁组织。2.Western blot结果显示肝癌细胞系中O-GlcNAcylation水平相较于正常肝细胞系有明显的升高,同时OGT也在癌症细胞系中升高。3.通过药物和慢病毒感染,能够有效的改变细胞内O-GlcNAcylation糖基化水平。伴随着糖基化水平的升高,癌症细胞增殖能力、克隆形成、侵袭转移能力也随之提高,同时裸鼠荷瘤的实验结果证明,O-GlcNAcylation水平的升高能促进癌细胞在体内的生长。反之,下调糖基化水平,肝癌细胞系的增殖、克隆形成能力及侵袭转移的能力下降。4.运用肝癌过表达OGT细胞系富集OGT的样本进行质谱分析,发现了214个与OGT相关的靶分子,并通过GO功能注释和KEGG通路分析发现与癌症相关的转录因子2个,通过查阅文献,确定与肝癌恶性表型及糖代谢密切相关的同源盒基因SIX1编码的SIX1蛋白为下一步重点关注的研究目标。5.网络数据库预测出相应SIX1糖基化位点10个。同时Co-IP实验结果证实OGT可与SIX1结合。随后我们通过改变细胞的糖基化水平后检测SIX1泛素化水平发现,糖基化水平升高后SIX1泛素化水平随之下降,提示O-GlcNAcylation水平的升高可保持SIX1及其下游分子的持续高表达,即O-GlcNAcylation可能通过影响SIX1的泛素化水平作用于肝癌的恶性表型。6.运用siRNA的方法,发现在OGT过表达的细胞中干扰SIX1后可以部分逆转OGT过表达对肝癌恶性表型的促进作用,进一步说明O-GlcNAcylation通过影响SIX1来影响肝癌的恶性表型。结论:O-GlcNAcylation糖基化水平在肝癌组织中表达水平明显升高并预示着较差的预后水平。伴随着糖基化水平的升高,肝癌增殖侵袭转移等恶性表型能力也随之提高。反之,下调糖基化水平,肝癌增殖侵袭转移等恶性表型能力下降。进一步研究显示O-GlcNAcylation可能通过影响SIX1的泛素化水平作用于肝癌的恶性表型。肿瘤细胞特殊的营养摄取模式使得细胞内的O-GlcNAc浓度升高,从而使包括SIX1在内的一系列蛋白的O-GlcNAcylation修饰水平升高,升高的O-GlcNAcylation修饰水平抑制了SIX1的泛素化降解,从而使得SIX1及其下游促癌基因保持在一个高表达的状态,进而促进了肝癌的增殖转移等恶性表型。