背景及目的:大肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,包括结肠癌与直肠癌两部分,其发病率及死亡率在恶性肿瘤中均位居前列。传统的治疗方法以手术治疗为主,结合放疗、化疗等辅助治疗。虽然患者们均可在不同程度上获益,且相关的技术或方案也在不断更新,但仍无法将其根除。据统计早期大肠癌患者,经治疗后其5年生存率可达90%,但仍有1.2%-4.9%的复发风险。进展期患者在经过手术、放化疗及靶向治疗后,5年生存率约为50%-78%。对于转移病灶不能手术的患者,5年生存率可能低于10%。且这些方法都在不同程度给患者带来身体及心理方面的痛苦,故人们一直在探寻着更好的肿瘤治疗方法。肿瘤的免疫疗法是通过诱导产生或增强针对肿瘤的免疫应答,达到杀死肿瘤细胞,治疗肿瘤的目的。与化疗等其他直接杀死肿瘤细胞的药物相比,可用于多种不同类型的晚期肿瘤的治疗。2013年,癌症的免疫治疗被《Science》杂志评为全球十大科学研究突破之首。《Nature》和《Science》在2013年和2015年相继推出肿瘤免疫治疗专刊。该疗法正逐渐成为除手术、放疗、化疗之外,第四类主要的肿瘤治疗方式。针对免疫检查点采取相应的干预是其中重要的方法。PD-1/PD-L1和CD47/SIRPα是两个重要的免疫检查点,阻断这两个免疫检查点可有效的阻止多种肿瘤的发生发展,在越来越多的动物实验,甚至临床前实验、临床实验中得到令人振奋的结果。然而,针对这两个免疫检查点的治疗策略,对结肠癌的治疗效果却并不理想,需开发新的有效治疗策略。RNA干扰是在转录后水平上发生的基因中的一种特异而强烈的沉默过程。在这个过程中,具有内源性或外源性来源的非编码双链RNA,即小干扰核糖核酸siRNA,干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA,阻止其翻译,从而使基因沉默。siRNA已被用于癌症治疗,比许多其他治疗方案具有明显的优势。但有效的将siRNA传递到靶组织是一个难题,血清核糖核酸酶引起的血管内降解、短半衰期、肾小球滤过引起的快速清除,以及网状内皮系统的清除,是siRNA分子遇到的几种生物屏障。为了克服这些困难,合适的siRNA递送系统至关重要。纳米颗粒被定义为至少在一个维度上小于100纳米的微小颗粒,包括脂质体、树状大分子、胶束、二氧化硅、量子点、金和碳纳米管等。借助其特殊的性质,如粒径、电势、材料组成和表面修饰,可以作为载体,用于药物、核酸等物质输送,沿血管和淋巴管循环,并能渗透进细胞膜中,从而增强被输送物质在肿瘤组织中的选择性聚集,在肿瘤的诊断及治疗中具有很高的疗效和准确性。PLGA纳米颗粒具有较低的全身毒性和较高的生物相容性,在许多关于肿瘤的治疗实验中,PLGA及经相关表面修饰的纳米颗粒可将其包载物出色的递送至肿瘤细胞中并释放,进而实现抗肿瘤作用。在装载DNA或RNA之前,借助阳离子聚合物的作用,PLGA可以更好的与带负电的核酸分子结合,增强细胞摄取,也增加了它们的溶解性和稳定性,增加了血液循环半衰期,同时降低了它们的免疫原性,减少了分子间聚集,最终避免了被网状内皮系统识别。更加利于核酸等物质的递送。基于以上的研究背景,我们利用双乳化法制备了包载siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒,通过体外实验验证其对siRNA有明显的保护作用,且可被肿瘤细胞吞噬并降低CD47及PD-L1表达,通过体内实验研究其在荷CT26结肠癌的BALB/c小鼠体内的分布情况及对荷CT26结肠癌的BALB/c小鼠的治疗效果及安全性等问题,并探究了其免疫微环境的改变。研究方法:1.通过双乳化法制备包载物为NCsiRNA、CD47siRNA、PD-L1siRNA、Cy5-NCsiRNA的PEG-PLGA纳米颗粒。通过扫描电镜拍摄了颗粒的形态,通过透射光散射仪对纳米颗粒的粒径、电势及包载率等表征进行了检测,并证明了颗粒对siRNA的保护能力。2.体外培养CT26细胞,分别通过流式细胞术和共聚焦显微镜证明了PEG-PLGA纳米可以被肿瘤细胞吞噬,并通过流式细胞术验证了包载CD47siRNA及PD-L1siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒可降低CT26肿瘤的CD47及PD-L1表达,与商业转染试剂Lipofectamine 2000的效果相仿。3.建立BALB/c小鼠的CT26结肠癌皮下肿瘤模型,制备了包载物为Cy5-NCsiRNA的PEG-PLGA纳米颗粒,通过尾静脉注射方式将其输送至于荷瘤的小鼠体内,通过小动物成像方式观察注射后活体小鼠体内及脏器离体后颗粒富集的情况。之后通过流式细胞术检测各组小鼠肿瘤、脾脏及引流淋巴结内颗粒在免疫细胞及肿瘤细胞上的富集情况,分析其免疫微环境的变化。4.建立BALB/c小鼠的CT26结肠癌皮下肿瘤模型,在种瘤后第三天通过尾静脉注射方式将包载物为NCsiRNA、CD47siRNA、PD-L1siRNA的颗粒输送至小鼠体内,观察不同组别的抗肿瘤效果。在治疗实验结束后处死小鼠,通过流式细胞术检测各组小鼠肿瘤、脾脏及引流淋巴结内免疫细胞的变化,探究其免疫微环境变化,并留取脏器组织做病理检测。研究结果:1.通过双乳化法合成了包载一种及两种siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒,颗粒的粒径在100nm左右,电势在20-40mV,包载率约90%,具有保护siRNA的作用,通过流式细胞术和共聚焦显微镜可见颗粒易被肿瘤细胞吞噬,且可以使CT26细胞的CD47及PD-L1表达下降。2.通过双乳化法合成的包载带Cy5荧光的siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒经尾静脉注射入荷CT26肿瘤的BALB/c小鼠中,通过小动物成像及流式细胞术可见颗粒在小鼠肺、肝、脾、肾等腹腔脏器及肿瘤、引流淋巴结中大量富集。3.尾静脉注射双乳化法合成的包载siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒对荷CT26肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤生长有抑制作用且安全性较好,其中以包载CD47siRNA的组别效果更好,而同时包载CD47siRNA及PD-L1siRNA的颗粒组别肿瘤抑制效果最好。通过流式细胞检测发现免疫微环境有相应改变。研究结论:1.通过双乳化法合成了包载一种或两种siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒,包载siRNA的种类不影响颗粒的粒径、电势、包载率,具有保护siRNA的作用,易被肿瘤细胞吞噬,且可以使CT26细胞的CD47及PD-L1在蛋白水平表达下降。2.通过双乳化法合成的包载siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒经尾静脉注射入CT26荷瘤的BALB/c小鼠中,颗粒可进入小鼠肺、肝、脾、肾等腹腔脏器及肿瘤、引流淋巴结中。3.尾静脉注射包载siRNA的PEG-PLGA纳米颗粒对CT26荷瘤的BALB/c小鼠的肿瘤生长有抑制作用且安全性较好,对小鼠免疫微环境有一定调控作用。