目的：反复妊娠丢失指自然流产连续发生3次或3次以上者,其发生率约占自然流产病例的3%-5%,但仍有50%-60%原因不明,称为不明原因反复妊娠丢失(URSA),严重影响着孕妇的身心健康。随着生殖免疫医学的发展,研究表明URSA主要与免疫因素有关,是母体对胎儿免疫排斥的结果。妊娠是一种同种异体移植,胚胎被母体的免疫机制识别并接纳后,妊娠才能得以正常维持。因此,诱导母体对同种异体胎儿抗原的免疫耐受是治疗的关键。国内外研究表明当前临床多采用免疫细胞过继疗法治疗URSA,诱导母体对同种异体胚儿抗原的免疫耐受,但是这种方法存在较多的局限性本研究采用流产实验动物模型,分析T细胞来源的非细胞成分Exosomes调节妊娠丢失孕鼠外周T细胞功能以诱导母胎免疫耐受,确定分析T细胞来源Exosomes取代传统“免疫细胞过继疗法”治疗妊娠丢失的免疫学机制,为今后开展临床应用奠定实验基础并提供理论依据。方法：1雄性无关个体脾细胞及其Exosomes的制备和初步鉴定：断颈处死BALB/c雄鼠,无菌条件下解剖取脾组织,获得单个细胞悬液,采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exosomes;通过扫描电镜、透射电镜观察Exosomes的形态、结构,紫外分光光度法测定其蛋白含量。2妊娠丢失实验动物模型的建立：雌雄小鼠随机分为4组后按2：1合笼交配；CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照组(Contro组),CBA/J(♀)×DBA/2(♂)为URSA组。再将URSA孕鼠分别于孕第4天无特殊处理,给予尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾单个核细胞及无关个体BALB/c雄鼠脾T细胞来源的Exosomes,随机分为妊娠丢失组(URSA组)、细胞治疗组(Cellular Therapy组)、非细胞治疗组(Non-cellular Therapy组)。3胚胎发育情况的观察：于妊娠第14天分别将各组CBA/J孕鼠处死,测量计算胎盘体积,计数各组吸收胚胎个数及存活胚胎个数,根据公式计算出胚胎吸收率及妊娠丢失率。4母胎免疫耐受状况的分析：于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠,无菌解剖取脾组织,制备单个脾细胞悬液。MTT染色法检测单向混合淋巴反应、双向混合淋巴反应中T细胞转化的A492值。5孕鼠外周T淋巴细胞免疫功能变化的检测：于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠,无菌解剖取脾组织,制备单个脾细胞悬液。直接荧光标记流式细胞计数(FCM)分别检测T细胞表面CD3、CD4、CD8、CD247、CD25、IL-17、CD28、CTLA-4的表达,分别计算CD3+、CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD3+、CD247+、CD4+、CD25+、IL-17+、CD4+、CD28+、CD4+、CTLA-4+细胞的百分率。6统计学处理：各组数据均通过SPSS13.0版本软件进行正态性、方差齐性检验,采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况；采用F检验对孕鼠T细胞免疫功能进行单因素方差分析(ANOVA),S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。结果：1雄性无关个体脾脏T细胞来源Exosomes的初步鉴定1.1形态及超微结构观察及蛋白定量扫描及透射电镜下观察,T细胞分泌的Exosomes为脂质双分子层膜包围的球体,呈椭圆形或圆形杯口状,胞膜完整,直径约为30nnm-100nm,内为低电子密度物质。紫外分光光度法蛋白定量显示Exosomes的A280值为0.343±0.029。2不同过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响Control组孕鼠的胚胎吸收率为5.25%,URSA组为20.78%,细胞治疗组、非细胞治疗组分别为7.81%、3.18%。与URSA组相比,细胞治疗组及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降(均P<0.01),并且均下降至Control组水平(均P＞0.05)；非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治疗组(P<0.05)。Control组孕鼠的妊娠丢失率为20%,URSA组为62%,细胞治疗组、非细胞治疗组分别为22%、22%。与URSA组相比,细胞治疗组及非细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降(均P<0.01),且均下降至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显差异(P>0.05)。3母胎免疫耐受状况的分析单向淋巴细胞混合反应,Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值(分别为0.584±0.060、0.697±0.035,0.411±0.024、0.313土0.191)。其中,Control组与URSA组之间明显差异P<0.05)；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下降(均P<0.05),细胞治疗组、非细胞治疗组无明显差异(P>0.05)。双向淋巴细胞混合反应,Control组、URSA组及细胞治疗组、非细胞治疗组孕鼠脾细胞的A492值(分别为0.551±0.308、0.478±0.116,0.702±0.126、0.563±0.134)。其中,Control组与URSA组之间有明显差异P<0.05)；细胞治疗组较之显著上升(P<0.05),非细胞治疗组较之无明显差异(P>0.05),细胞治疗组、非细胞治疗组有明显差异(P<0.05)。4外周T淋巴细胞功能的检测4.1CD4、CD8的表达变化与Control组外周T细胞CD3表达百分率(33.47%±11.78%)相比,URSA组表达百分率显著升高(43.43%±5.41%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后无明显变化(分别为42.17%±7.43%,41.62%±7.21%,P>0.05),两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05)。与Control组外周T细胞CD4+CD8-表达百分率(23.09%±3.02%)相比,URSA组表达百分率显著升高(29.02%±5.74%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为20.25%±7.70%、22.86%±8.98%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。与Control组外周T细胞CD4-CD8+表达百分率(30.64%±1.55%)相比,URSA组表达百分率显著降低(27.24%±1.70%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高(分别为32.45%±2.12%、31.72%±0.98%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义P>0.05)。与Control组外周T细胞CD4/CD8表达百分率(1.04%±0.21%)相比,URSA组表达百分率显著升高(1.50%±0.63%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为1.06%±0.11%、1.06%±0.29%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P＞0.05)。4.2CD3+CD247+的表达变化与Control组外周T细胞CD3+CD247+表达百分率(3.77%±1.79%)相比,URSA组表达百分率显著降低(0.13%±0.06%,P<0.01)；经细胞治疗非细胞治疗后显著升高(分别为3.30%±0.99%、3.57%±0.78%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。4.3调节性T细胞的表达变化与Control组外周T细胞CD4+CD25+表达百分率(1.68%±0.75%)相比,URSA组表达百分率显著升高(1.26%±0.85%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为2.00%±0.89%、2.10%±0.70%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。与Control组外周T细胞IL-17+表达百分率(2.49%±0.14%)相比,URSA组表达百分率显著升高(1.21%±0.11%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为2.24%±0.52%、2.38%±1.02%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。4.4正负向协同刺激因子细胞表达的变化与Control组脾细胞CD4+CD28+表达百分率(4.91%±1.21%)相比,URSA组表达百分率显著下调(1.73%±0.84%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著升高(分别为4.05%±1.23%、4.12%±1.28%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。与Control组脾细胞CD4+CTLA-4+表达百分率(0.82%±0.08%)相比,URSA组表达百分率显著升高(3.08%±0.37%,P<0.01)；经细胞治疗、非细胞治疗后显著降低(分别为0.77%±0.11%、1.20%±0.30%,均P<0.01)至Control组水平(均P>0.05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。结论：1过继转输雄性个体外周T淋巴细胞或其分泌的非细胞成分Exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受,过继转输Exosomes可发挥更强的母胎免疫耐受诱导效应。2雄性个体外周T淋巴细胞及其分泌的非细胞成分Exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母体外周T淋巴细胞功能发生变化,有效诱导母胎免疫耐受。3进一步明确了雄性个体外周T淋巴细胞及其分泌的非细胞成分Exoso-mes诱导母胎免疫耐受的免疫学机制,为今后开展临床应用奠定实验基础并提供理论依据。