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天冬氨酸蛋白酶即通常所称的酸性蛋白酶是内肽酶,其活性位点是两个天冬氨酸。天冬氨酸蛋白酶家族在酸性或中型pH条件下有活性,其代表性特征是将两个疏水氨基酸打断。胃蛋白酶家族成员都有两裂片的结构,三维空间结构显示是有两个对称的折叠,在两裂片之间存在有活性位点的裂缝。活性部位天冬氨酸残基以Asp-Xaa-Gly模式存在。 本文首先PCR扩增得到微小毛霉酸性蛋白酶（凝乳酶）结构基因并测定其核苷酸序列,用DNAman软件分析其核苷酸序列及推衍得到的多肽序列,结果表明扩增得到的片段为凝乳酶基因。构建了重组菌Pichia pastorisKM71/pPIC9K-mcp,通过G418抗性筛选得到具有多拷贝基因的整合重组菌MK3。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得重组菌MK3凝乳酶活力为5.4 U/ml,蛋白水解活力为3 U/ml。 通过序列比对,我们发现在N.crassa基因组中有一长为1182bp的编码基因与富氏葡萄孢盘菌,米曲霉等微生物酸性蛋白酶基因的酸性蛋白酶编码基因有一定的同源性,且该基因的结构基因中含有微生物酸性蛋白酶活性中心常有的Asp-Xaa-Gly保守序列。通过PCR扩增出N.crassa酸性蛋白酶结构基因,将其插入到带有酵母信号肽α因子的表达载体pPIC9K的EcoR Ⅰ位点,正向连接的重组质粒pPIC9K-ap经Nco Ⅰ酶切纯化后,电转化入巴斯德毕赤氏酵母GS115。重组菌NA3经甲醇诱导表达出有活性的酸性蛋白酶,酶活为6.8 U/ml。 PCR扩增得到酿酒酵母W303A-1 PGPD基因。在之前构建成功的pPIC9K-ap基础上,构建了pPIC9K-PGPD-ap酵母整合型重组质粒,转化工业酒精生产菌酿酒酵母825,通过G418抗性筛选得到整合重组菌APS。经YEPD发酵,测得其酸性蛋白酶酶活为6.5 U/ml后,将重组菌APS进行酒精发酵,在相同时间段对照于野生酒精生产菌酿酒酵母825,其酒精度均有所提高。