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细胞凋亡(apoptosis)参与了多种心血管疾病的发生及发展,如心肌梗死、心力衰竭及心律失常。心肌细胞为终末分化细胞,不具有分化潜能,因此抑制心肌细胞凋亡,保护心肌细胞正常功能对治疗多种心血管疾病有重要意义。凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是由基因控制的细胞主动死亡形式,伴有一系列的生化及形态学改变。细胞凋亡早期细胞体积减小即凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease,AVD),是凋亡的一个重要的形态学特征。近年来,大量证据提示AVD及激活的离子通道在细胞凋亡过程中起着重要的作用,是细胞凋亡的重要前提;在多种细胞,通过阻断激活的离子通道及细胞体积减小可以抑制细胞凋亡。氯离子是机体内最重要,最丰富的阴离子,膜片钳证实细胞凋亡伴有氯离子电流激活,阻断激活的氯离子电流能抑制减轻细胞凋亡,但是其内在的信号机制尚不清楚。因此本实验的目的是在建立心肌细胞凋亡模型的基础上,观察氯离子通道阻断剂对细胞存活及凋亡的影响,并首次探讨了非特异性氯离子通道阻断剂DIDS对细胞内促存活信号通路PI3K/Akt及下游分子eNOS/NO(nitric oxide,NO),Bcl-2/Bax的影响。研究目的1.原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,经典的线粒体途径凋亡诱导剂staurosporine(STS)建立心肌细胞凋亡模型,观察氯离子通道阻断剂对心肌细胞存活及凋亡的影响。2. STS诱导心肌细胞凋亡过程中,氯离子通道阻断剂DIDS对细胞存活信号通路PI3K/Akt及其下游分子eNOS/NO的影响。3.氯离子通道阻断剂DIDS对STS诱导心肌细胞凋亡的Bcl-2家族Bcl-2/Bax的影响。实验方法1.实验设立阴性对照组(正常对照组),阳性对照组(诱导凋亡组)及实验组(给予不同的氯离子通道阻断剂)。2. STS诱导心肌细胞凋亡,相差显微镜观察细胞形态学变化,Hoechst-33258染色观察细胞核的形态学变化。3.四唑盐(MTT)比色法观察心肌细胞的存活率;底物酶解荧光法检测caspase-3活性,反映心肌细胞的凋亡程度;DNA“梯”状条带(DNA ladder)检测心肌细胞凋亡的发生。4.氯离子通道阻断剂DIDS,NPPB及phloretin对STS处理心肌细胞存活率与凋亡的影响。5.免疫印迹方法观察氯离子通道阻断剂DIDS对细胞促存活信号通路PI3K/Akt及其下游分子eNOS/NO的影响;硝酸还原酶法测定细胞无酚红培养上清NO水平。6.免疫印迹方法观察DIDS对Bcl-2/Bax表达的影响;免疫荧光双染色观察DIDS对STS处理的心肌细胞Bax分布的影响,免疫印迹法半定量DIDS对细胞线粒体及胞质片断Bax水平的影响。实验结果1. STS浓度依赖性,时间依赖性的降低了原代培养心肌细胞的存活率,升高了caspase-3活性;4μmol/L STS处理8 h细胞存活率为42.9%,caspase-3活性为4.52,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01 vs. control),DNA琼脂糖凝胶电泳有明显的DNA-ladder形成。正常心肌细胞,形态规则,搏动规律,而STS诱导的凋亡细胞,明显皱缩变圆,细胞触角减少,细胞间距增加,大多数细胞停止搏动。Hoechst-33258染色对照组心肌细胞核呈圆形或者椭圆形,染色均匀;STS处理细胞,大多数细胞核不规则,固缩,有明显的核分叶和碎裂等典型的凋亡特征。说明4μmol/L STS诱导8 h可以成功建立心肌细胞凋亡模型。2. STS诱导凋亡的同时应用氯离子通道阻断剂250μmol/L DIDS,100μmol/L NPPB,及30μmol/L phloretin,细胞存活率分别为77.4%,70.1%及74.4%,与阳性对照组比较有显著性差异(P<0.01 vs. control);caspase-3活性较STS组明显降低,且无明显的DNA“梯”状条带形成;细胞形态较阳性对照组规则,Hoechst-33258染色阳性细胞明显减少。说明氯离子通道阻断剂可以明显抑制细胞凋亡,促进细胞存活。3.氯离子通道阻断剂可以明显抑制STS诱导的心肌细胞凋亡,我们首次探讨了非特异性的氯离子通道阻断剂DIDS抑制细胞凋亡的分子学机制。蛋白免疫印迹发现在正常对照组,STS诱导凋亡组及DIDS与STS同时处理组,Akt的表达无明显变化;但是与STS阳性对照组比较,同时应用DIDS明显升高了p-Akt水平(P<0.01 vs. STS),LY294002预处理可以完全抑制p-Akt的升高,而且可以阻断DIDS提高细胞存活率、降低caspase-3活性的作用;但是单独应用DIDS在1,2,4及8 h四个时间点,p-Akt与对照组无明显变化,说明DIDS并不能直接激活细胞内PI3K/Akt信号。提示在STS诱导的心肌细胞,DIDS发挥抗凋亡作用可能与PI3K/Akt信号通路激活有关。4. STS诱导细胞凋亡明显降低了细胞内eNOS及p-eNOS的水平,同时加入DIDS提高了eNOS,p-eNOS的水平(P<0.01 vs. STS),LY294002预处理可以完全抑制DIDS的上述作用;eNOS通过促进NO生成对细胞起重要保护作用,为进一步证明eNOS在DIDS促细胞存活中的作用,硝酸还原酶法检测了细胞培养上清NO水平,结果与p-eNOS一致,STS诱导细胞凋亡,NO水平较正常对照组明显降低,当同时应用DIDS则明显升高了细胞上清NO水平(P<0.01 vs. STS),应用LY294002预处理可以完全阻断升高的NO,非特异性NOS阻断剂L-NAME预处理也可以清除DIDS升高的NO水平,但仅部分阻断了DIDS的细胞保护作用(细胞存活率,caspase-3活性及DNA-ladder形成)。提示PI3K/Akt信号下游分子eNOS/NO升高部分参与了DIDS的抗凋亡作用。5. DIDS对STS诱导心肌凋亡的Bcl-2,Bax表达无明显影响。提示DIDS并非通过调节Bcl-2/Bax表达发挥其抗凋亡作用。6.应用免疫荧光双染方法,激光共聚焦显微镜显示,正常细胞促凋亡蛋白Bax主要分布在细胞质,STS诱导心肌细胞凋亡过程中伴有明显的Bax蛋白线粒体转位;DIDS可以抑制STS诱导的Bax线粒体转位,而且可能与激活的PI3K/Akt信号通路存在内在的联系,PI3K的特异性阻断剂LY294002预处理,细胞重新呈现Bax线粒体转位。进一步通过分析细胞线粒体及胞质片段Bax蛋白的水平,结果显示正常细胞线粒体Bax处于较低水平;STS诱导细胞凋亡线粒体Bax的水平明显升高,说明细胞凋亡过程中伴有明显的Bax线粒体转位;STS诱导细胞同时应用DIDS可以明显抑制线粒体Bax水平的升高,且PI3K的特异性阻断剂LY294002预处理可以清除DIDS抑制Bax转位的作用。进一步提示DIDS可能通过激活PI3K/Akt信号通路明显抑制STS诱导的Bax蛋白线粒体转位,也参与了DIDS的抗凋亡效应。结论1.氯离子通道阻断剂DIDS,NPPB及phloretin,能够抑制STS诱导的心肌细胞凋亡,提高细胞存活率。2. DIDS通过激活PI3K/Akt信号通路发挥其抑制STS诱导的心肌细胞凋亡的作用;并首次证实激活的PI3K/Akt信号通路下游分子eNOS/NO部分参与了DIDS的抗凋亡、保护细胞的效应。3.首次证明DIDS明显抑制了STS诱导心肌细胞凋亡过程中促凋亡蛋白Bax由胞质向线粒体的转位,且可以被特异性PI3K阻断剂LY294002预处理完全阻断。提示DIDS抑制Bax蛋白线粒体转位与激活的PI3K/Akt信号通路有关,也参与了DIDS的细胞保护作用。