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研究背景 骨质疏松是全球医学界共同关注的问题，目前使用的一些预防或治疗骨质疏松症的方法如运动疗法、饮食疗法、药物疗法等可以减少骨量的丢失，降低骨折的危险性。但是这些方法对身体骨量增加非常有限，不能恢复已经丢失的骨量，充其量只能使骨折的发生率降低50％；特别是药物治疗效果与临床实际要求相差甚远，因为迄今为止临床使用的各种抗骨质疏松药物如雌激素、选择性激素受体调节剂、降钙素、二磷酸盐等，都以抑制骨吸收为主要目的，从严格意义上讲仅仅起到了“预防”作用，达不到“治疗”要求，因此寻找有效的“治疗”药物成为当今骨质疏松研究的一个重要课题。我们的前期实验证明PDGF-AA因子具有促进成骨细胞增殖和分化，加速骨折愈合等功能，提示PDGF-AA有可能为骨质疏松的治疗提供一种新的手段。因此有必要在以往研究基础上进一步探索，阐明PDGF-AA对骨组织代谢的影响，为PDGF-AA进入骨质疏松研究提供充分的证据。 目的 1．建立成骨细胞-破骨细胞共育体系，为骨代谢转换的研究提供新的手段； 2．探讨PDGF-AA在骨代谢转换中的作用，为PDGF-AA应用于骨质疏松研究提供充分的科学证据； 3．克隆PDGF-AA基因并构建携带该基因的高效表达重组腺病毒，为PDGF-AA的大量制备和体内转染实验奠定基础，为PDGF-AA进入骨质疏松治疗实验阶段准备条件。 方 法1．取成人骨松质分离培养成骨细胞和破骨细胞，建立成骨细胞－破 骨细胞共育模型。2．以MTT法检测成骨细胞增殖、对硝基苯酚法测定成骨细胞碱性 磷酸酶（ALPase）活性、流式细胞仪检测成骨细胞的增殖周期； 以破骨细胞总酸性磷酸酶（TACPase）、抗酒石酸酸性磷酸酶 （TRAPase）和 ATP酶（ATPase）活性以及破骨细胞骨吸收陷 窝面积代表破骨细胞的破骨能力，分析共育对成骨细胞和破骨细 胞各自功能的影响。3．采用方法2中的指标，检测PDGF－AA对单独培养和共同培育条 件下成骨细胞和破骨细胞功能的影响，分析PDGF－AA在骨代谢 转换平衡中的作用。4．培养正常人体成骨细胞，提取细胞总RNA，RT．PCR方法获得 PDGFAA的编码基因。将该片段克隆到高效表达腺病毒载体 Adeno－X，并经过HEK293细胞的包装，获得成熟的重组腺病毒 体。PCR方法确认重组病毒体所携带的PDGF－AA编码基因。 Western Blot方法检测 PDGFAA的表达。利用成熟重组腺病毒 感染成骨细胞，免疫组化方法检测细胞胞浆内PDGFAA蛋白的 表达，并检测 PDGF－AA转基因表达对细胞增殖和 ALPase活性 的影响。5．统计分析：采用SPSS10刀软件包。两样本均数比较，若方差 齐，做矿检验；若方差不齐，做秩和检验。多样本均数比较， One－wny ANOVA分析，组间比较用 LSD方法。 结 果l 成骨细胞呈饱满梭形，ALPase染色阳性；破骨细胞呈多核， TRAPase染色阳性，可吸收骨质形成骨陷窝。成骨细胞与破骨细 胞共育后，其 MTT OD 值（0石010刀8）较单独培养时 5 （0．36t0．03）明显提高（P＜0．001），成骨细胞的 ALPase活性 （270．24t28．61）u／mg较单独培养时（222．63t6．36）u／mg明显增 强（P＜0刀01）。破骨细胞与成骨细胞共育后，形成的平均骨吸 收面积（6．5510．34）xlo“‘pm‘较单独培养时（5．1510．17）x10－ ～ 明显增大（P＜0．001）。上述结果表明，在共同培育体系 中，成骨细胞和破骨细胞的功能相互促进。2．共育和 PDGFAAu0ng加l，以下浓度相同）可使成骨细胞增殖 MTT OD值从m38to．05）分别增加到（0．46L0．06，P＜O．05）和 （0石2士0刀3，P＜0刀1），当P＊G卜＊A作用于共育体系中的成骨 细胞后，成骨细胞增殖 MTT OD值进一步增加到（0．72t0．11， P＜0刀5），表明在共育体系中，P＊G卜＊A的促增殖作用得到加 强。3．PDGF．AA 使单独培养成骨细胞的ALPase 活性 从 （69二斗7士47刀6）增加到（886．48士104二3，P＜0刀5），而对共育 体系中的成骨细胞，其促进作用更明显 ＊．35ti61．29， P＜0刀01）。表明P＊＊F＊A可促进单独培养体系中成骨细胞的 ALPase活性，且该作用在共育体系中得到加强。4．在破骨细胞培养上清中加入PDGF－AA后，破骨细胞Na＋－K＋、 Mg针、C广和 Ca付－Mg什 ATPase的活性分别从（0．24士 0刀012）、（0．2423土0刀179）、（0．1661士00083）、（0．2476 士0刀552）下降到（0．1421土0刀20，P＜0刀01）、（O．1M7士 0刀24，P＜0刀5）（0刀760土0刀2叩，P＜0刀5）（0．1犯3土队刀101， P＜0．05）。表明 PDGF－AA可以明显降低破骨细胞表面 ATPase 的活性。5．PDGFAA对破骨细胞的 TACPase和 TMPase无明显影响。骨吸 收陷窝测量表明PDGFAA不抑制单独培养破骨细胞的破骨功能 （4．7510．37）X10”ZpffiZ（