骨组织是由细胞、纤维和多种坚硬单晶体及其基质构成的特殊结缔组织,在骨缺损等骨科疾病的治疗中骨重建是一种重要的替换机制,不仅依赖于其所处于的周围力学环境对骨组织细胞的力学效应,还需要骨支架材料作为其成骨相关细胞的载体。骨组织细胞能感受力学刺激并转化为生物化学信号从而调节相关骨代谢活动,从而适应力学载荷并改变自身结构。除此,传统的加工方法很难精确控制材料内部的孔隙结构,导通率也不能控制,严重影响支架内细胞代谢,血管生成。采用低温结合3D打印成型技术可构建所需的三维结构,通过冷冻干燥,溶剂升华,可构建出大量微细的孔隙,同时低温下成型避免了由于热相变的存在对材料生物活性的影响。研究目的:研究复合三维复合材料的理化性质、生物相容性以及生物降解性;力学刺激对于材料复合细胞增殖、分化的影响;研究力学刺激对复合材料在动物体内成骨效应的影响,为骨缺损等相关疾病治疗提供一定理论依据,进而解决相关临床问题。研究方法:1.本研究采用丝素、胶原、羟基磷灰石为主要原料,通过仿生原理构建具有二级三维立体结构的仿生骨支架材料,这三种材料均具有较好的生物相容性,可可以通过调节三者的配比控制材料的理化性质与降解性能。2.采用丝素、胶原、纳米羟基磷灰石共混后在四点弯曲加载装置的培养小室制备二维仿生骨材料复合膜,测定力学性能并进行形貌观察;通过四点弯曲加载装置分别对复合膜上的细胞施加2500με、5000με的力学刺激,观察细胞在复合膜上受力后的形态,检测其增殖、凋亡情况以利用RT-PCR、WB技术检测相关成骨相关的基因Runx2、OCN、ColⅠ、BMP-2的m RNA及蛋白表达情况。3.采用丝素、胶原、纳米羟基磷灰石共混后经过低温3 D打印联合冷冻干燥技术制备三维仿生骨支架,在体外将此支架进行酶解,利用XRD、FTIR、SEM等技术评价此支架在体外的降解性能;将支架移植入成年大白兔皮下,于2w、4w、8w、12w、16w取材行SEM、HE以及Masson染色,评价其体内降解性,为进一步植入体内作骨缺损修复做进一步的准备探讨。4.将制备的三维仿生骨支架分别移植到新西兰大白兔的桡骨中段(15 mm的长段骨缺损)以及山羊的跖骨上段(25*10*1.5 mm的矩形骨缺损),并采用LMHFV(低强度高频率振动)对山羊进行持续和间歇振动,分别在2w、4w、8w、12w进行X线、Micro-CT等影像学检查以及Hedberg评分、免疫组化染色、血清学中的成骨与破骨指标以及生物力学的测试。实验结果:1.力学性能测试结果提示制备的仿生骨材料具有较一致的力学性能,复合支架孔径、孔隙率、吸水率、弹性模量均符合构建组织工程骨的要求;扫描电镜显示羟基磷灰石在复合膜中均匀分布,细胞黏附在复合膜上,呈长梭形拉伸状;对复合膜上细胞加载3 d、7 d后进行检测,结果显示5000με组鬼笔环肽染色、流式、TEM结果显示细胞微丝变粗、凋亡数目增多、细胞核凹陷,出现细胞崩解;2500με组细胞数量、ALP含量、Runx2、OCN、ColⅠ、BMP-2的m RNA及蛋白表达均高于其余二组(P<0.05),5000με组均低于对照组(P<0.05)。2.体外降解实验结果表明复合支架第2、4、6、8周降解了49.62%、62.05%、69.91%、77.44%。XRD及FTIR结果提示仿生骨支架中规则性较差的非结晶区域首先被攻击而溶解;扫描电镜结果则显示随着时间的降解,孔隙逐渐减少,出现塌陷,且表面有裂痕。体内实验结果表明在材料降解的早期阶段(2-4周),材料表面可见大量中性粒细胞及巨噬细胞浸润;中期阶段(4-12周)可见成纤维细胞逐渐增多,大量多核细胞形成,偶可见新生血管形成,周围组织机化包裹,未见坏死征象;晚期阶段(12-16周)大部分支架内部基本崩解,组织细胞进一步长入材料,分割材料,组织细胞与残存材料共存,血管形成增多。3.体内兔桡骨中段山羊跖骨骨缺损修复实验,术后X线、Hedberg评分、Micro-CT均显示移植支架组愈合率明显高于未放支架的空白组。大体形态学、组织学以及双荧光染色检查显示移植支架组新生成骨面积大于未放支架的空白组,支架修复组的骨缺损处有大量骨痂形成,骨髓腔再通、骨细胞以及骨小梁的结构重新排列,部分可见板层骨生长以及破骨细胞对骨质吸收。未放支架的空白组骨缺损处可见纤维组织或软组织嵌入以及新生编织骨或类骨组织,将两端骨髓腔封闭,缺损中央未见明显的骨小梁生成,与尺骨相连的缺损的底部可见部分骨膜反应,类骨组织生长,膨大生长向缺损中央推进。4.血清学指标结果显示在实验的前中期(2-8w)OCN相对含量实验组明显高于对照组,实验后期(8-12w)低于对照组,TRACP-5b相对含量在前中期(2-8w)实验组明显低于对照组,实验后期(8-12w)高于对照组;生物力学测试显示在骨缺损中心处的弹性模量振动组弹性模量略大于对照组,但无统计学意义,中心外10mm、20mm处实验组弹性模量均大于对照组。结论:1.本实验制备的丝素、胶原、羟基磷灰石仿生骨材料具有优良的理化性质以及生物相容性。2.施加的力学刺激在正常生理范围内,则可以促进细胞增殖、分化,促进成骨相关基因的表达,有利于骨折修复及骨重建;超过一定生理强度的力学刺激,则可以抑制细胞增殖,抑制成骨相关基因的表达,促进细胞凋亡从而降低骨量,导致骨损伤。3.胶原酶首先侵袭仿生骨材料的无规则卷曲结构,瓦解相关结构区域。随着材料的进一步降解,由于β-折叠结构有较强的抵抗降解能力,β-折叠结构百分含量逐渐升高,材料的无定形结构趋于稳定,结晶度逐渐提高,材料的降解速率逐渐减缓。4.3D打印支架植入体内后与周围组织具有较好的生物相容性,新生血管的长入能为骨缺损修复提供营养。支架的降解速率与骨缺损修复的速率相符合,既能在前期有效引导骨修复,又能在修复基本完成后降解、吸收让出空间,为组织工程血管化奠定了良好的基础。5.在实验的前中期(2-8周),LMHFV通过促进成骨活性,抑制破骨来促进骨痂的形成。在实验的后期(8-12周),实验组经振动刺激后,上调破骨相关基因的表达,在骨缺损处形成了足够的骨痂后,增强了改造塑型期破骨细胞活性,加快了骨重建的进程。