肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国的第二大恶性肿瘤死因,占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%。我国每年约有23万人死于肝癌,占全球的53%[2]。肝癌的早期发现率不高,绝大多数患者被诊断时已失去了手术切除的机会,肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)成为不能手术切除肝癌的首选治疗方法。作为姑息性治疗选择,TACE治疗存在其先天不足,一方面TACE很难完全杀灭所有肿瘤细胞,残癌的存在限制了其远期疗效；另一方面,有证据表明,TACE治疗会促进肝癌肺转移,从而制约了患者的远期生存[3-5]。上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在特定生理和病理情况下,上皮细胞在形态学上发生向间质细胞表型转变,其在胚胎器官发育、组织纤维化和修复、肿瘤侵袭转移等病理生理过程中都发挥着重要的作用。研究表明,TACE治疗肝癌后残癌侵袭和转移能力增强,而EMT是其中一重要机制[6-8],抑制或逆转残癌EMT有望抑制TACE后残癌的侵袭能力,进而改善肝癌的预后。中药复方松友饮(中国FDA批准号：国食健字G20070160)松友饮是我国著名医学专家汤钊猷院士治疗肝癌、胃癌等恶性肿瘤的中医验方,主要由黄芪、丹参、枸杞子、焦山楂、炙鳖甲5味中药提取物组成,由中国科学院上海药物研究所确定该方剂及各组方高效液相指纹图谱(HPLC-FP)。我所前期的体外研究表明,“松友饮”抑制肝癌MHCC97H增殖,诱导肝癌凋亡并激活caspase-3;抑制基质金属蛋白酶-2(MMP2)活性及VEGF分泌,降低肝癌侵袭转移潜能。体内实验结果与体外实验结果趋势一致,应用松友饮组肺转移发生率下降。本课题组的另一组资料表明,发现经奥沙利铂治疗后的肝癌裸鼠模型中肿瘤组织,再次接种至裸鼠后,其肺转移的发生率显著高于对照组,上皮间质化(EMT)现象增多。相比对照组,应用松友饮(4.2和8.4g/kg))后,显著降低肺转移发生(13/15 vs6/15和3/15),其癌组织中的EMT现象减弱。但松友饮联合TACE治疗不能手术切除肝癌的临床疗效尚不明确,且松友饮是否能够抑制EMT,从而降低转移潜能的作用机理尚有待于进一步探索[11]。本项研究中,我们通过临床试验探讨TACE联合松友饮治疗对肝癌患者预后的影响；并拟从分子机制角度,探索松友饮对EMT的调控作用及机制。第一部分 松友饮联合TACE治疗不能手术切除的肝癌的临床研究目的：观察松友饮联合TACE治疗不能手术切除肝癌的疗效和不良反应。方法：2009年12月至2011年6月共44例不能手术切除肝癌患者纳入本组研究,入组患者随机分成两组,治疗组23例,对照组21例。治疗组采用松友饮联合TACE治疗,松友饮服用方法为每日2次,每次1包,连续服用6月。对照组单纯性TACE治疗,比较两组间的疗效和不良反应。客观疗效采用RESIST标准进行评价,采用Kaplan-Meier法计算中位生存期和生存率, 并以Log-rank法进行比较。结果：全组患者的中位生存期为10.5个月,其中治疗组16.5个月,对照组7个月,两组患者总生存期差异无统计学意义(P=0.677)。当设定观察终点为12月时,可发现治疗组患者生存率高于对照组,6、9、12月生存率两组分别为69.57%、60.87%、55.8%和56.12%、40.18%、40.18%(P=0.33)。客观疗效比较提示：以6月为随访期,有36例可行疗效评价,两组均无CR病例,治疗组的PR为10.53%(2/19),SD为15.79%(3/19),PD为73.68%(14/19)；对照组的PR为0,SD17.65%(3/17)为,PD为82.35%(14/17)。治疗相关不良反应少见,主要为恶心、呕吐等胃肠道症状,两组间无显著差异。结论：松友饮联合TACE治疗进展期肝癌患者有延长患者生存趋势,并有可能提高治疗有效率。进一步大样本量临床试验值得期待。第二部分 松友饮调控上皮间质转化的分子机制探索目的：探索研究松友饮调控上皮间质转化的分子机制方法：采用TGF-β诱导肝癌细胞株MHCC97L和MHCC97H发生EMT,加入梯度浓度的松友饮共培养,48h后采用RT-PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光检测EMT相关指标的变化,细胞功能实验探讨松友饮对肿瘤侵袭和迁移能力的作用。结果：划痕实验、Transwell迁移实验证实松友饮可抑制肿瘤细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验证实松友饮可抑制肿瘤细胞的侵袭能力。Western Blot的结果提示松友饮可浓度依赖性的上调E-cadherin的表达(8mg/ml松友饮共培养组相比TGF-β组,P=0.01),对N-cadherin、snail、slug的表达无抑制作用。细胞免疫荧光提示松友饮可逆转E-cadherin的表达。RT-PCR的结果显示松友饮可上调E-cadherin的表达,拮抗TGF-β对E-cadherin的抑制作用(8mg/ml松友饮共培养组相比TGF-β组,P<0.01),但对调控E-cadherin表达的转录因子(snail、 slug、zeb1、zeb2、twist、E47、KLF8)并无抑制作用。结论：本实验证实松友饮可部分抑制TGF-β引起的EMT改变,上调E-cadherin的表达,可抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,但松友饮调控E-cad表达的途径仍然需要进一步探索。结论松友饮联合TACE治疗有延长患者生存趋势。体外实验证实松友饮可拮抗TGF-β的作用,上调EMT通路中的关键蛋白E-cadherin的表达,并抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。松友饮有望成为TACE治疗后改善预后的辅助用药。创新点1.首次探索松友饮联合TACE治疗肝癌患者的临床疗效,并发现其有延长患者生存趋势。2.首次从分子机制角度探索松友饮对EMT的调控作用,证实松友饮能通过上调E-cad的表达来抑制EMT,为松友饮辅助治疗肝癌提供理论依据。