组织蛋白酶B（cathepsin B,CTSB）是溶酶体蛋白酶家族的成员,参与哺乳动物卵母细胞成熟并影响后续胚胎发育能力。颗粒细胞则是卵泡重要组成部分,对于卵泡发育和卵母细胞成熟起到调控作用。本试验为探究CTSB对绵羊颗粒细胞功能的影响及其作用机制,构建CTSB过表达载体质粒pcDNA3.1-C:TSB和抑制CTSB表达的siRNA,并转染体外培养的绵羊颗粒细胞作为试验组（CTSB过表达组、CTSB表达抑制组）,并设空白组和阴性对照组,采用CCK8方法检测颗粒细胞的增殖、Annexinv-FITC/PI法检测颗粒细胞凋亡及细胞周期,并利用qRT-PCR检测CTSB信号通路相关基因的表达水平,系统分析CTSB对绵羊卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡、细胞周期及其相关基因的影响,试验结果如下:通过扩增CTSB基因的CDS编码区,构建含有EcoR I+Nhe I双酶切位点的CTSB过表达载体（pcDNA3.1-CTSB）,并合成干扰CTSB基因的RNA（siCTSB）。用荧光定量PCR和Western Blot方法检测CTSB过表达和干扰效率,结果显示:pcDNA3.1-CTSB显著提高CTSB的表达,而siCTSB显著降低CTSB的表达,表明CTSB过表达载体质粒pcDNA3.1-CTSB和抑制CTSB表达的siRNA构建成功。CCK8方法检测pcDNA3.1-CTSB和siRNA转染颗粒细胞24 h后的细胞增殖情况,结果表明:CTSB过表达组极显著抑制颗粒细胞增殖（P<0.01）,而CTSB表达抑制组极显著促进颗粒细胞增殖（P<0.01）。采用Annexinv-FITC/PI双染法检测颗粒细胞转染24h的细胞凋亡情况,结果显示:CTSB过表达组颗粒细胞的凋亡率极显著升高（P<0.01）,检测凋亡相关基因mRNA表达水平发现:过表达CTSB极显著上调了 Bax、Caspase3凋亡基因的表达（P<0.01）,显著上调了凋亡基因p53表达（P<0.05）,Bcl-2基因表达差异不显著（P>0.05）;干扰抑制CTSB基因表达能够极显著降低颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,同时极显著上调Bcl-2基因表达（P<0.01）,显著下调Bax、p53的表达（P<0.05）,Caspase3凋亡基因表达量差异不显著（P>0.05）。采用流式细胞仪检测转染24 h后的细胞周期结果显示:CTSB过表达使颗粒细胞处于G0/G1期细胞比例极显著升高（P<0.01）,处于S期和G2/M期的细胞比例极显著降低（P<0.01）,并极显著上调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、p21的mRNA表达量（P<0.01）;干扰抑制CTSB基因表达使G0/G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,G2/M期细胞比例与对照组无显著差异（P>0.05）,同时使细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的mRNA表达量极显著下调（P<0.01）,细胞周期抑制因子p21的mRNA表达量显著上调（P<0.05）。综上所述,CTSB通过影响Cyclin B1、Cyclin D1、p21基因的表达负向调控颗粒细胞增殖和细胞周期进程;通过影响Bax、p53等基因表达正向调控颗粒细胞凋亡。可为深入探究CTSB基因调控绵羊卵泡发育提供理论依据。