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目的:近年来,肺癌以其不断攀升的发病率和死亡率迅速成为全球范围内严重威胁人类健康的恶性疾病之一。因此,找寻在肺癌发生发展过程中的有效生物学标志对提高肺癌患者的生命质量和生存时间具有非常重要的意义。pre-mRNA的可变剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,也是引起癌症表达的天然来源。许多癌基因受可变剪接调控,而某一个或某些可变剪接异构体的转换,可能在肿瘤发生、发展中起关键作用,成为癌症的特异性可变剪接模式。PPP1R13L是一种新的癌基因,存在2个常见可以编码蛋白的可变剪接异构体PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,两者在环境致癌物所致肺癌的发生发展中可能发挥不同的生物学功能,呈现出某种肺癌特异性可变剪接模式。本研究通过基因芯片和生物数据库等方法筛选与肺癌相关的癌基因PPP1R13L的可变剪接异构体,并采用临床肺癌及癌旁组织样本、BPDE诱导细胞恶性转化模型及体外细胞转染模型深入挖掘和探讨PPP1R13L基因两个候选可变剪接异构体在肺癌变过程中的特征表达和相关机制。阐明高表达PPP1R13L-SV可以通过抑制P53的凋亡功能,促进细胞恶性转变,认为PPP1R13L-SV是PPP1R13L基因在肺鳞癌恶性变过程中的特异性可变剪接模式,为肺癌特异性可变剪接模式的研究提供重要的理论基础,也为其精准预防和早期诊断提供新的思路和靶标。研究方法:首先,自2013年6月至2018年6月,收集中国医科大学附属第一医院胸心外科及辽宁省肿瘤医院胸外科行肺癌手术治疗的患者组织样本100余例。签写知情同意书后实施。通过患者咨询和病理报告结果填写调查表:除记录既往病史、家族史、生活方式等一般人口学特征之外,还要详细记录肿瘤类型、分期、肿瘤大小、淋巴结转移等肺癌病理学特征。根据Affymetrix基因芯片技术和生物信息学软件（UCSC等）的综合分析结果,对可能与肺癌发生发展相关的PPP1R13L基因可变剪接异构体进行预测和筛选,并通过RACE试验验证各可变剪接异构体。在癌组织及其癌旁组织中,采用实时定量及RT PCR检测PPP1R13L候选可变剪接体和P53基因mRNA的表达水平,Western blot观察PPP1R13L候选转录本蛋白表达情况,整体及分层分析PPP1R13L候选转录表达与其临床病理特征之间的关联,并通过实时定量PCR和Western blot结果分析在癌组织中P53表达与PPP1R13L候选可变剪接异构体的相关性。其次,采用低剂量多环芳烃类致癌物BPDE体外诱导16HBE建立细胞恶性转化模型,通过细胞划痕、Transwell小室体外侵袭实验、软琼脂克隆实验、裸鼠成瘤实验等观察不同代数转化细胞恶性程度的变化,并对致瘤组织进行HE染色和免疫组化分析其病理类型,鉴定16HBE细胞是否成功癌变,P53基因测序分析恶性转化后细胞的P53基因型。在恶性转化过程中,采用realtime PCR和Western blot检测PPP1R13L基因两种可变剪接异构体mRNA水平和蛋白表达的变化,观察两者之间表达的变化规律。最后,设计PPP1R13L基因两种可变剪异构接体的过表达质粒和siRNA,分别体外转染293T和16HBE细胞,同时利用CRISPR-Cas9体系精准敲除PPP1R13L-L转录本构建内源性下调PPP1R13L-L的16HBE和16HBE-40T细胞模型,在明确施加环境致癌因子BPDE后,采用流式细胞仪比较各组转染细胞的凋亡差异,免疫荧光实验检测染毒前和染毒后各组转染细胞P53核内表达变化。结果:1.根据基因芯片技术和UCSC数据库筛选,RACE实验检测确定在人群和细胞系中均有表达且可能与肺癌相关的PPP1R3L转录本PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,排除患者信息收集不全和组织质量不达标准的样本,最终样本量确定为98例。在98例肺癌患者中,PPP1R13L-SV可变剪接异构体在癌组织中mRNA表达水平明显高于癌旁（P<0.05）,而P53基因mRNA表达水平在癌旁组织中明显升高（P<0.05）,在临床病理特征分层分析中发现,与癌旁组织比较,年龄大于60岁（包括60岁）的人群PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平明显升高,而P53基因mRNA表达水平在癌组织中表达明显降低（P<0.05）。吸烟患者PPP1R13L-SV可变剪接异构体在肺癌组织中mRNA表达水平要明显高于癌旁组织（P<0.05）。在鳞癌组织中PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平升高,同时P53基因mRNA表达水平降低（P<0.05）,而且在肺腺癌和肺鳞癌组织蛋白检测对比分析中也发现同样的趋势。在肺鳞癌组织中,当肿瘤直径≥3cm时,PPP1R13L-SV明显高表达（P<0.05）,同时P53基因低表达（P<0.05）,在有淋巴结转移的情况下,PPP1R13L-SV高表达（P=0.054,为临界值,认为差异具有统计学意义）,在恶性肿瘤高分期组（Ⅲ/Ⅳ期）,PPP1R13L-SV呈高水平表达（P<0.05）,而P53基因呈低水平表达（P<0.05）,PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA或蛋白表达水平与P53 mRNA或蛋白表达水平呈负相关（P<0.05）。在15例肺癌患者癌、癌旁及远端组织,PPP1R13L-SV可变剪接体在癌、癌旁及远端组织中mRNA表达水平呈下降趋势（F=11.183,P<0.05）,但癌旁与远端组织中PPP1R13L-SV蛋白表达无明显差别。2.通过1μM BPDE体外诱导16HBE细胞恶性转化,随着细胞恶性转化代数的增加,细胞核质比逐渐变大,由分散生长状态变为成簇聚集生长,细胞划痕面积比值呈逐渐下降趋势（P<0.05）,细胞的侵袭能力及恶性增殖能力不断增强,16HBE-40T侵袭能力及恶性增殖能力与LK2几乎相同。在裸鼠成瘤试验中,通过对成瘤组织病理切片HE染色和免疫组化,鉴定为肺鳞癌,并对16HBE-40T细胞P53 exon5-8测序分析,确定为P53野生型。而在细胞恶性转化过程中,PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV可变剪接异构体mRNA表达水平均呈波浪式上升,P53 mRNA表达水平则曲折下降,在蛋白检测中PPP1R13L-SV和P53蛋白与mRNA水平的表达趋势均相同,而PPP1R13L-L蛋白表达则与其mRNA表达水平具有不一致性。3.设计PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV的过表达质粒和siRNA,分别体外转染293T和16HBE细胞。过表达质粒有绿色荧光标签,转染48h后荧光显微镜下可见绿色荧光,PPP1R13L-L或PPP1R13L-SV在各自转染细胞中的mRNA水平和蛋白表达量均高于转染EV质粒的细胞,siRNA转染细胞并无荧光表达,仅是通过mRNA水平和蛋白表达量的变化判断转染效率。PPP1R13L-L或PPP1R13L-SV在各自siRNA转染细胞中mRNA水平和蛋白表达量均低于转染NC对照组细胞,证明细胞转染模型构建成功。BPDE染毒24h后,各组细胞凋亡率均有升高的趋势。在转染siRNA未染毒的293T细胞中,与NC组比较,si PPP1R13L-L和si PPP1R13L-SV组凋亡均明显增加（P<0.05）,但经BPDE染毒后,仅si PPP1R13L-SV组凋亡显著增加（P<0.01）;在过表达质粒转染的293T细胞中,未染毒处理时,与EV组比较,OE PPP1R13L-L和OE PPP1R13L-SV组细胞凋亡均无明显变化。但经BPDE染毒后,OE PPP1R13L-SV组细胞凋亡比EV组明显减少（P<0.05）,16HBE细胞各组凋亡情况与293T细胞表现基本一致。同样我们在免疫荧光试验中发现,经BPDE染毒24h后,与未染毒时相比,各组细胞核内荧光强度均有升高的趋势。与NC组比较,si PPP1R13L-L和si PPP1R13L-SV组核内红色荧光强度均明显增加（P<0.05）,但经BPDE染毒后,仅si PPP1R13L-SV组核内红色荧光强度明显增加（P<0.05）;OE PPP1R13L-SV组细胞核内红色荧光强度比EV组明显减少（P<0.05）,转染的16HBE细胞核内红色荧光强度与293T细胞表现基本一致。利用CRISPR-Cas9体系精准敲除PPP1R13L-L转录本构建内源性下调PPP1R13L-L的16HBE和16HBE-40T细胞模型,在荧光显微镜下观察,可见过细胞表达绿色荧光蛋白,Westen blot检测后确定转染成功。BPDE染毒24h后,各组细胞凋亡率均有升高的趋势。未染毒处理时,16HBE Cas+kdL3组和16HBE-40T Cas+kdL3组细胞凋亡无明显差别;但BPDE染毒后,16HBE Cas+kdL3组细胞凋亡比16HBE-40T Cas+kdL3组明显升高（P<0.05）,而16HBE-40T Cas+EV组和16HBE-40T Cas+kdL3组细胞凋亡并无明显差别,免疫荧光实验细胞内荧光强度的变化与凋亡检测结果一致。结论:1.在人群肺癌组织样本研究中提出PPP1R13L-SV可能通过影响P53的表达而成为在肺鳞癌发生发展的过程中起关键作用的可变剪接模式,可能作为预测肺鳞癌恶性转化的生物标志。2.BPDE体外诱导16HBE细胞恶性转化,根据基因测序和病理分析鉴定获得的16HBE-40T为P53野生型肺鳞癌细胞,并且PPP1R13L-SV是16HBE细胞在BPDE诱导下向肺鳞癌转化过程中的特异性可变剪接模式。3.高表达PPP1R13L-SV可以通过抑制P53的凋亡功能,促进细胞恶性转变,认为PPP1R13L-SV是PPP1R13L基因在肺鳞癌恶性变过程中的特异性可变剪接模式。