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茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物体中广泛存在并且具有高效调节作用的内源激素之一,尤其对萜类、生物碱类和黄酮类的次级代谢产物的生物合成具有重要的调控作用。但由于JA信号激素能够同时引起细胞凋亡等一系列副反应,从而限制了其实际应用。因此,通过阐释JA信号通路调控植物次级代谢产物的模式,并以此为基础构建转基因细胞系,不仅能够提高目标产物的含量,而且能够有效地避免副反应损害。紫杉醇是中国红豆杉体内一类重要的二萜类物质,对于治疗乳腺癌和卵巢癌具有良好的疗效。但是,由于其生物体内含量低且合成步骤复杂,从而严重制约了其商业化生产。本文对中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式进行研究,以期为构建紫杉醇高产细胞系奠定基础。本文首先通过对中国红豆杉中紫杉醇合成酶基因启动子上的顺式作用元件进行克隆和分析,然后以关键的JA信号响应元件为诱饵,筛选与其相互作用的转录因子,从而阐明JA信号通路调控紫杉醇合成的下游模式。同时,鉴定中国红豆杉中的JA信号通路中的关键节点JAZ(Jasmonate-ZIM domain)和MYC2因子,以研究中国红豆杉中JA信号通路上游响应的调控方式及其与下游响应之间的相互作用。结合以上结果,从而能够阐明JA信号调控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要结果如下:(1)JA调控紫杉醇合成模式中的的靶点筛选。对TASY,T5H,T10H,T13H,TAT和T7H 6个紫杉醇合成酶基因的启动子进行了克隆和研究,发现E-box,G-box和T/G-box等JA-responsive顺式作用元件广泛存在于紫杉醇合成酶基因启动子上,表明MYC2是响应JA信号并调控紫杉醇生物合成的重要转录因子。其中,紫杉醇合成酶TASY基因启动子与PR(Pathogen-Related)、STR(Strictosidine synthase)、PMT2(putrescine N-methyltransferase 2)等JA响应基因的启动子具有相同结构,即近端分布的T/G-box及串联的G-box和GCC-box顺式作用元件,说明TASY是JA调控紫杉醇合成模式中的的重要靶点,同时也表明了ERF(Ethylene Responsive Factor)和MYC2转录因子在JA调控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此,本文以筛选调控tasy基因表达的erf和myc2为切入点,然后进一步揭示两类转录因子在ja信号调控紫杉醇合成模式中发挥的作用。(2)与jre元件相互作用的tcerfs的克隆与功能分析。启动子活性分析表明t/g-box、cgtca-motif和gcc-box是tasy基因响应ja的功能元件,其中gcc-box发挥了最关键作用。根据gcc-box能够特异与erf类转录因子相互作用的特性,从中国红豆杉转录组中筛选获得94个ap2/erebp转录因子。进一步研究发现其中23个蛋白序列具有erf的特征碱基。分析meja处理前后两个细胞系的转录组发现,表达量发生显著变化的有13个:其中4个表达量显著上升,9个表达量显著下调。利用序列分析等筛选得到两个erf类转录因子tcerf12和tcerf15,两者分别编码典型的b1和b3类gcc-box-bindingerf转录因子。酵母单杂交、红豆杉细胞体内共表达及超表达实验均表明,tcerf12和tcerf15能够通过结合gcc-box而分别抑制和激活tasy基因的表达。(3)ja信号途径上游基因tcmyc2的克隆及功能验证。在中国红豆杉转录组数据库中筛选得到具有完整的myc2转录因子特征结构的tcmyc2,其蛋白序列与atmyc2、ntmyc2和crmyc2具有极高的相似性,进化分析也表明它们具有极近的亲缘关系,意味着tcmyc2在红豆杉中有相似的作用。tcmyc2与tasy启动子顺式作用元件的相互作用实验证明,tcmyc2能够与t/g-box、g-box相互作用并进而激活tasy基因表达。而且,tcmyc2不仅能够激活tasy,t5h,tat,bapt,t13h等紫杉醇合成酶基因,还能够激活tcerf12和tcerf15的表达。以上结果表明,tcmyc2对于响应ja信号并调控植物次级代谢产物合成具有重要作用。(4)ja信号途径上游基因tcjaz的克隆及功能验证。通过对红豆杉中tcjaz基因的研究发现,除groupv亚家族外,其他的jaz蛋白在裸子植物与被子植物中具有不同的进化路径。因此,挑选groupv亚家族中的tcjaz3作为研究红豆杉中ja信号通路的目标因子。酵母双杂交实验证明,tcmyc2能够与tcjaz3相互作用,tcjaz3能够在红豆杉体内与tcmyc2结合从而抑制其活性。表明中国红豆杉体内同样存在jaz-myc沉默体的调控模式。综上,本文初步总结了以tcerf12/15、tcmyc2和tcjaz3为核心的ja信号调控中国红豆杉紫杉醇生物合成的模式,为构建高产转基因细胞系或植株奠定了基础。同时,本文初次报道了TcERF12响应JA信号并负调控植物次级代谢产物合成的现象,为完善JA信号调控网络奠定了基础。